mRNA疫(yi)苗(miao)在(zai)covid-19疫(yi)情出(chu)圈后，基于(yu)mRNA開發新療(liao)(liao)法(fa)更加(jia)受到關注，包括mRNA傳染(ran)病疫(yi)苗(miao)、腫瘤(liu)免疫(yi)療(liao)(liao)法(fa)（癌癥疫(yi)苗(miao)）、治(zhi)療(liao)(liao)性蛋白質替(ti)代療(liao)(liao)法(fa)和遺傳疾病治(zhi)療(liao)(liao)等。 

基于mRNA技術的covid-19廣泛使用。目前，全球范圍內已有2種mRNA疫苗獲得FDA的EUA（緊急使用授權），分別是由德國BioNTech、輝瑞和復星醫藥共同研發的BNT162b2（有效率95%）以及美國Moderna公司研發的mRNA-1273（有效率94.1%）。

在國內，由沃森生物、蘇州艾博生物、軍事科學院軍事醫學研究院共同研制的mRNA covid-19ARCoV將于5月30日起在墨西哥開始III期試驗；斯微生物的mRNA疫苗也進入了I期臨床試驗。

既(ji)然(ran)mRNA疫(yi)(yi)苗這么(me)受歡迎，今天我們就來講講mRNA疫(yi)(yi)苗是如何體外制備的。

mRNA疫苗(miao)的(de)制備(bei)

以covid-19為例，我們首先分離出病毒株，測序及分析獲得病毒的完整基因序列，然后通過基因工程技術，利用化學合成的方式，合成S刺突蛋白所對應的病毒RNA片段，為了方便接下來的RNA大量復制，RNA片段首先在DNA聚合酶的作用下，發生逆轉錄合成雙鏈DNA結構。在基因克隆技術中，通常將要復制的DNA嵌入到載體質粒中，利用細菌快速繁殖，培養，復制出大量嵌入S蛋白DNA質粒的細菌，經過提取，分離，純化等工藝，得到大量純凈S蛋白DNA。S蛋白DNA通過使用轉錄試劑完成體外轉錄得到大量mRNA,mRNA單獨存在時結構并不穩定，所以在最終制成疫苗時，需要在mRNA外層包裹一層脂類，最終完成mRNA疫苗的制備。

mRNA的結構及優化(hua)策略

1 mRNA加帽

真核(he)(he)細胞mRNA的5'端(duan)有一個帽(mao)(mao)子結(jie)構，它是在(zai)mRNA轉錄后(hou)，由甲基化的鳥苷(gan)酸（m7G）經焦磷酸化與mRNA的5'端(duan)核(he)(he)苷(gan)酸相連。5'端(duan)帽(mao)(mao)子結(jie)構在(zai)mRNA許多生(sheng)物學功能(neng)中起到重(zhong)要的作用，這(zhe)包(bao)括：mRNA的剪切、穩定(ding)、轉運和核(he)(he)糖體的募(mu)集等(deng)。由于5'端(duan)帽(mao)(mao)子結(jie)構的重(zhong)要生(sheng)物學功能(neng)，在(zai)mRNA疫(yi)苗(miao)研發過(guo)程(cheng)中需要優(you)化5'端(duan)帽(mao)(mao)子結(jie)構，并利用合(he)適的工藝對(dui)mRNA原料進行“加帽(mao)(mao)”。

mRNA疫苗產品的(de)(de)(de)(de)加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)可以在mRNA的(de)(de)(de)(de)體外轉錄過(guo)程中通過(guo)摻入“帽(mao)(mao)子(zi)序(xu)列(lie)”實(shi)現，這種加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)技術會將(jiang)加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)序(xu)列(lie)反(fan)向加(jia)(jia)(jia)(jia)在mRNA上，這會導致約1/3的(de)(de)(de)(de)加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)失敗。通過(guo)摻入特殊的(de)(de)(de)(de)帽(mao)(mao)子(zi)結構——“anti-reverse”帽(mao)(mao)子(zi)結構（ARCA）可以降低(di)這種反(fan)向加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)失誤(wu)的(de)(de)(de)(de)出現。另(ling)外，還可以先合(he)成不帶帽(mao)(mao)子(zi)結構的(de)(de)(de)(de)mRNA，再利用(yong)痘病毒的(de)(de)(de)(de)“加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)復合(he)物”對mRNA進行加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)，這也是一種mRNA的(de)(de)(de)(de)加(jia)(jia)(jia)(jia)帽(mao)(mao)手(shou)段。

2.非翻(fan)譯區序列（UTRs）修(xiu)飾

在(zai)mRNA的(de)編碼區兩端(duan)各存在(zai)一段(duan)非翻譯區（UTRs），在(zai)5'端(duan)的(de)被稱為5'端(duan)UTR，在(zai)3'端(duan)的(de)被稱為3'端(duan)UTR。

非翻(fan)(fan)譯區序列不(bu)是(shi)密碼子(zi)，不(bu)能翻(fan)(fan)譯成氨基酸，但是(shi)可以通過RNA結合蛋(dan)白(bai)控制mRNA產品(pin)的(de)(de)(de)降(jiang)解和轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)效(xiao)率(lv)。因此(ci)(ci)，每一種mRNA疫苗(miao)都需要考慮如何設計產品(pin)的(de)(de)(de)UTR組(zu)(zu)件(jian)(jian)，進而(er)提高在目的(de)(de)(de)細胞(bao)中(zhong)mRNA疫苗(miao)的(de)(de)(de)穩定性和轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)效(xiao)率(lv)。大(da)量的(de)(de)(de)研究發現非洲(zhou)爪蟾和人源的(de)(de)(de)α-球蛋(dan)白(bai)/β-球蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)UTR序列非常(chang)穩定，而(er)且能夠增加異源的(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)表達效(xiao)率(lv)，因此(ci)(ci)這兩個蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)UTR原件(jian)(jian)通常(chang)被設計為mRNA疫苗(miao)的(de)(de)(de)UTR組(zu)(zu)件(jian)(jian)。當然(ran)，也有其它(ta)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)UTRs被研究用于mRNA疫苗(miao)的(de)(de)(de)組(zu)(zu)件(jian)(jian)，在此(ci)(ci)不(bu)再贅述。

3.Poly（A）

大多數真(zhen)核(he)生物(wu)的(de)(de)mRNA 的(de)(de)3'端都有由(you)100~200個腺苷酸聚(ju)合(he)形成的(de)(de)Poly（A）尾巴。mRNA的(de)(de)Poly（A）尾巴可以和(he)(he)(he)5'端帽(mao)子(zi)(zi)(zi)結(jie)構共同合(he)作，增(zeng)強(qiang)mRNA結(jie)構的(de)(de)穩定性(xing)。Poly（A）尾巴首先和(he)(he)(he)大量的(de)(de)Poly（A）結(jie)合(he)蛋白(bai)（PABP）結(jie)合(he)，然后(hou)募(mu)集(ji)真(zhen)核(he)生物(wu)起始因子(zi)(zi)(zi)4G（eIF4G），增(zeng)加(jia)Poly（A）跟5'端帽(mao)子(zi)(zi)(zi)結(jie)構的(de)(de)親和(he)(he)(he)力，最終mRNA的(de)(de)Poly（A）尾巴和(he)(he)(he)5'端帽(mao)子(zi)(zi)(zi)結(jie)構首尾相(xiang)接，形成環裝mRNA。環裝mRNA結(jie)構有利于核(he)糖體的(de)(de)募(mu)集(ji)，其特殊(shu)的(de)(de)結(jie)構也(ye)能保護(hu)mRNA不被降(jiang)解。

在mRNA體外合成(cheng)(cheng)過(guo)程(cheng)中，Poly（A）尾(wei)巴(ba)可以通過(guo)質粒DNA模板(ban)轉錄獲得，也(ye)可以先合成(cheng)(cheng)mRNA再通過(guo)Poly（A）聚合酶(mei)加(jia)上(shang)不(bu)同單位數(shu)量的尾(wei)巴(ba)。前(qian)者能夠在mRNA產品(pin)中加(jia)入特定數(shu)目(mu)的Poly（A），而后者加(jia)入的單位數(shu)不(bu)確定。

Poly（A）尾巴(ba)的單位數目對于其(qi)生(sheng)物學作(zuo)(zuo)用起到了至關重要(yao)的作(zuo)(zuo)用。在(zai)哺乳動物細胞內，活(huo)躍表(biao)達的mRNA包(bao)含的Poly（A）序列(lie)的長(chang)度為100-250個。有研(yan)究發現，表(biao)達效(xiao)率越高的mRNA，其(qi)Poly（A）尾巴(ba)越短。但是當Poly（A）單位長(chang)度小于12時，mRNA結構就不再穩(wen)定，容易被降(jiang)解。在(zai)設計mRNA疫苗產品的序列(lie)時，Poly（A）的長(chang)度也是非常重要(yao)的優化指標。

4. 開(kai)放(fang)閱(yue)讀框

開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）包涵了mRNA的(de)全部編碼(ma)序列(lie)，負責(ze)進入人(ren)體后(hou)表達mRNA運(yun)載(zai)的(de)抗原靶蛋白。

密碼子(zi)水平(ping)的(de)修飾，利(li)用常用的(de)密碼子(zi)，選用tRNA較多的(de)密碼子(zi)；使各個密碼子(zi)的(de)比例更接近(jin)靶(ba)物種或(huo)者細(xi)胞的(de)比例；

GC含量的(de)(de)(de)修飾，避免復(fu)雜二級(ji)結(jie)構(gou)(gou)(gou)形成；二級(ji)結(jie)構(gou)(gou)(gou)對mRNA的(de)(de)(de)延(yan)伸(shen)和(he)(he)轉錄非常重要，高穩定的(de)(de)(de)二級(ji)結(jie)構(gou)(gou)(gou)和(he)(he)發夾結(jie)構(gou)(gou)(gou)需要避免。這樣的(de)(de)(de)二級(ji)結(jie)構(gou)(gou)(gou)可(ke)以阻止核糖體的(de)(de)(de)進入、掃描以及容易被先天性免疫(yi)識別(bie)為PAMP。

mRNA疫苗制備試(shi)劑盒(he)：

Cellscript   T7 mScript™ Standard mRNA Production System  C-MSC11610/C-MSC100625

該試劑盒包含T7 RNA聚合酶，加帽酶，加尾酶，以及2'-O-甲基轉移酶， 可以(yi)一站式解決(jue)mRNA制備(bei)過程。

T7-FlashScribe™ Transcription Kit  C-ASF3507  以1ug線性化的DNA為模板，在30min內體外轉錄可以得到180ug的RNA。

其他相關(guan)產品(pin)

北京和一生物作為Cellscript的國內授權代理，為你提供CellScript公司全套的mRNA生產的原料，目前產品主要包括體外轉錄試劑盒，帽類似物，加帽酶，加尾酶，以及一些修飾核苷等等，北京和一生物為你提供全套mRNA制備的解決方案，助力抗擊covid-19，期待你的咨詢！