mRNA(信使核糖核酸)疫苗是一種能夠激發人體自身對特定抗原免疫反應的新型技術,它攜帶有mRNA的信息,其中包括特定病毒特征(即病毒抗原)的“藍本"或者代碼。這些信息使人體能夠自行合成病毒抗原:mRNA將生產抗原所需的信息輸送到人體制造蛋白的細胞機器中,然后,人體細胞將抗原呈遞到細胞表面,從而誘導所需的特定免疫反應。當人體接觸到對應的病毒時,免疫系統會識別出特定抗原,從而精準且迅速地攻擊病毒來阻止感染。
mRNA的(de)生產過程——
1、DNA原(yuan)液(ye)制備;
我(wo)們首先需要設計與(yu)構建含有S蛋(dan)白基因序列的載體,然后通過大腸桿(gan)菌放大培養,獲得大量的攜帶S蛋白基因序列的質粒(li)。
2、mRNA原(yuan)液的制備;
獲取的攜帶S蛋白基(ji)因序(xu)列(lie)的質粒線性化{(噬菌體啟(qi)動子(T7)-5 UTR-開放閱讀框(ORF)-3 個非(fei)翻譯區(UTR)-polyA}通(tong)過體外轉錄(IVT)將(jiang)前(qian)mRNA5'端加帽子。后(hou)續需(xu)要經過一系列(lie)的純化,除菌等過程(cheng)。除去酶、游離核苷酸、殘留 DNA 和外源 RNA 片段,dsRNA, 及反應體(ti)系中的(de)免疫原性雜(za)質。滿足 GMP 生(sheng)產的質量需求。
Moderna的(de)mRNA還需(xu)要(yao)把尿(niao)苷替(ti)換成(cheng)假尿(niao)苷,以降(jiang)低免疫原性。
3、利用(yong)脂質微(wei)粒進行包封。
制(zhi)備遞(di)送系統,例如(ru)基于聚合物或脂質的納米顆粒(LNP),然后使用不同制造(zao)商不同的方法將純化的mRNA封裝在(zai)其中。由此(ci)產生的mRNA/遞送納米顆粒組件(jian)經(jing)過濃(nong)縮、緩沖液交(jiao)換和無菌過濾。然后最終評估并(bing)按此順序包(bao)裝成(cheng)袋/瓶作為原(yuan)料藥(yao)。原(yuan)料藥(yao)通常在最(zui)(zui)終(zhong)形成(cheng)(盡(jin)管不(bu)適(shi)用于某(mou)些工藝)最(zui)(zui)終(zhong)藥(yao)物產品填充之前冷(leng)凍儲存(cun),在某(mou)些情況下隨后還需要(yao)進(jin)行凍干。
在NGS及合(he)成技術的(de)(de)快速發展的(de)(de)今(jin)天,病毒遺(yi)傳(chuan)信息序列(lie)的(de)(de)解讀及序列(lie)合(he)成已不是難(nan)題。如(ru)何將合成好的(de)mRNA序列遞送進(jin)入人體細(xi)胞變(bian)成了mRNA疫苗研發的重要(yao)挑戰之(zhi)一。
人(ren)體(ti)(ti)細胞結構(gou)從(cong)外至內可分(fen)為細胞膜(cell membrane)、細胞質(cytoplasm)、細胞核(nucleus)。mRNA翻(fan)譯成(cheng)蛋(dan)白質的過程(cheng)發生在細胞質中,因此,mRNA疫(yi)苗要發(fa)揮作用,必須先將(jiang)編輯好(hao)的mRNA遞送進細胞質中。
進(jin)入細(xi)胞(bao)質需要通過(guo)細(xi)胞(bao)膜(mo)(mo),細(xi)胞(bao)膜(mo)(mo)由磷脂(zhi)雙分(fen)(fen)子(zi)層構成,磷脂(zhi)分(fen)(fen)子(zi)頭部(bu)具有親水(shui)性,尾部(bu)具有疏水(shui)性,兩(liang)層磷脂(zhi)尾部(bu)相對形成雙分(fen)(fen)子(zi)層,能(neng)夠有效控(kong)制水(shui)分(fen)(fen)子(zi)、離子(zi)、大分(fen)(fen)子(zi)物質通過(guo)。mRNA作為大分子(zi)(300-5000kDa),在不破(po)壞細胞(bao)(bao)膜的(de)前提下(xia),進出細胞(bao)(bao)只能(neng)以內含體(endosome)通過(guo)胞吞作用(endocytosis)。
通常情況(kuang)下,內含體進入細胞質后,會被直接(jie)送至溶酶體(lysosome)進(jin)行分解。為保證mRNA在翻譯前保持完(wan)整性,mRNA需要在內含(han)體與溶(rong)酶體結合前(qian)打破內含(han)體包膜(mo)(endosomal disruption)并逃(tao)離。
逃離內含體(ti)進入細胞(bao)質后,mRNA便會在(zai)細胞質內游動(dong),直(zhi)至到達核糖體(ribosome)并在此轉譯為(wei)肽鏈,最終折(zhe)疊(die)成為(wei)蛋白質。
對于mRNA疫苗和藥物,遞送系統有(you)兩大職責:
1、有效包裹和保(bao)護mRNA在(zai)到達靶點(dian)前維持穩定,
2、幫助mRNA有效成(cheng)分進入細胞(bao),
3、在mRNA到達溶酶體前將其(qi)釋放進入細胞質中(zhong)。
LNP是目(mu)前有潛(qian)力的遞(di)送載體之一。LNP(Lipid Nanoparticle)是脂(zhi)質(zhi)微粒的總稱,其(qi)中又(you)包括脂(zhi)質(zhi)膠團(micelle)、脂質體(ti)(liposome)等。LNP與細胞膜的(de)組成成分相似,均由脂(zhi)質(zhi)分子構成。脂(zhi)質(zhi)分子的(de)兩條長尾(wei)通常呈平行(xing)狀(zhuang)態,在此狀(zhuang)態下,脂(zhi)質(zhi)形成的(de)雙分子層穩定。
在(zai)(zai)進入細胞質(zhi)酸(suan)性環(huan)境后,部(bu)分(fen)脂(zhi)質(zhi)的(de)頭部(bu)質(zhi)子(zi)化,呈現陽離子(zi)形態,與其他陰性離子(zi)態的(de)脂(zhi)質(zhi)分(fen)子(zi)相吸引,尾部(bu)張開。原本雙(shuang)分(fen)子(zi)層的(de)形式被破壞,形成(cheng)頭部(bu)聚集(ji)在(zai)(zai)一起的(de)環(huan)狀。之(zhi)前包裹在(zai)(zai)內(nei)的(de)mRNA便可逃逸出(chu)內含體,進入細胞質(zhi)翻譯(yi)。
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