ArcticZymes Technologies成立(li)于20世紀80年代(dai)后(hou)期(qi)，總部位于挪威北部的特羅姆瑟(Troms?)。立足(zu)北極海(hai)洋(yang)區(qu)，致力于(yu)從(cong)海(hai)洋(yang)生(sheng)物(wu)中識別新的冷(leng)適應酶，用于(yu)分子研究、體外診(zhen)斷和治療(liao)領域。ArcticZymes專注于與全球(qiu)的(de)合作伙伴(ban)和商業創(chuang)新者建立牢固可靠的(de)關系。因此，我們一(yi)(yi)直(zhi)在探(tan)索并開發更(geng)加不(bu)一(yi)(yi)樣的(de)產(chan)品，不(bu)斷滿(man)足并且超過合作伙伴(ban)的(de)期望。

HL-SAN熱(re)不穩定性(xing)耐高鹽(yan)核酸(suan)酶70910-202 

描述(shu)

無論是(shi)實驗室(shi)規模(mo)樣品制(zhi)備、還是(shi)生產規模(mo)工藝過程，去除核酸都可(ke)以改(gai)善(shan)工藝流程，如蛋白純化、病毒載體制(zhi)備、mNGS中樣(yang)品處(chu)理等(deng)過(guo)程。而核(he)酸酶的選擇(ze)，就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱(re)不穩定(ding)性耐(nai)高鹽核(he)酸酶，HL-SAN) 是一(yi)種(zhong)(zhong)非特(te)異性(xing)(xing)內切酶(mei)(mei)，在(zai)高(gao)鹽(yan)濃度下具有較佳活性(xing)(xing)；且該酶(mei)(mei)在(zai)多種(zhong)(zhong)緩沖液(ye)中都有活性(xing)(xing)，很容易通過還原劑處理而失(shi)活。這(zhe)些特(te)性(xing)(xing)使HL-SAN在(zai)需要(yao)去除DNA和RNA的應用中，更為適(shi)合(he)。

核酸污染(ran)，特別是宿主(zhu)基(ji)因(yin)組DNA污(wu)染，在幾(ji)乎所(suo)有(you)工(gong)藝流程及(ji)生物制品的生產中，都(dou)是需要重(zhong)點解(jie)決的問題。一方面，宿主DNA的存在(zai)，影(ying)響目標產物的純化及下(xia)游質量分析等。另一(yi)方(fang)面，宿主DNA殘留能引起機體嚴重的(de)免疫反應，是生(sheng)物制品的(de)關鍵質量(liang)參數(shu)之一，FDA及NMPA等(deng)對Host Cell DNA (HCD)有嚴(yan)格的質控要求。

宿主(zhu)基因組DNA中，組蛋白(bai)與DNA形成核小體(ti)，核小體(ti)緊密折(zhe)疊(die)形成結(jie)構復雜的染(ran)色質。組蛋白與DNA間(jian)存在強烈(lie)的離子作用(yong)及疏水作用(yong)，再(zai)加上特殊的結構，導致宿主DNA很難被準確檢測并清(qing)除。已有文獻表明，高鹽(yan)濃度下(xia)組蛋白與DNA解(jie)離相對(dui)很好，這有利于宿主(zhu)DNA的檢測及去除。但市售的絕大(da)多(duo)數核(he)酸酶在高鹽(yan)(yan)濃度下活(huo)性很(hen)弱，甚至全部失(shi)活(huo)。而耐高鹽(yan)(yan)的HL-SAN成了(le)這類應用的理想(xiang)選擇。

高(gao)鹽濃(nong)度能夠提高(gao)去除(chu)效率

HL-SAN是一種新型的(de)、耐高(gao)鹽的(de)工(gong)程化(hua)內切酶。該酶在(zai)0.5 M NaCl條件下具有(you)較佳活性，是去除宿主(zhu)DNA污(wu)染的理(li)想選擇。

鹽濃(nong)度(du)是去除過(guo)程(cheng)的重(zhong)要參(can)數之一(yi)。高(gao)鹽濃(nong)度(du)下，宿主DNA與蛋白質能(neng)夠全(quan)部解離，從(cong)而更容易被降解。

推薦(jian)應用

1. 病(bing)原微生物診(zhen)斷應用，如(ru)宏(hong)基因組測序（mNGS）樣品去除(chu)宿主DNA；

2. 蛋白純化，特別(bie)是DNA結合蛋白；

3. 病毒(du)載體制備(bei)，如腺(xian)相關(guan)病毒（AAV）、腺病(bing)毒（AdV）等(deng)；

4. 其他需(xu)要去除宿(su)主DNA的應用(yong)等(deng)。

優勢

1. 高(gao)鹽條件下，DNA清除效率更高，宿主DNA殘留更少；

2. pI為9.6，容易跟絕(jue)大多數蛋白分離；

3. 還原劑存在時，酶易失活(huo)，減少(shao)對后續(xu)流(liu)程的(de)影(ying)響。

4.溫度穩定

5.在低溫下(xia)活躍（6℃時為20%）

實驗數據：

Figure 1. HL-SAN的(de)特性

使用指(zhi)導

1. DNA去除方案(an)

從細胞抽(chou)提(ti)物(wu)或細胞裂(lie)解液中去除DNA污染(ran)，HL-SAN的使用量受到多種(zhong)因(yin)素影響，如細胞類型、裂解液組成、NaCl濃(nong)度、Mg2+濃度、裂解液pH等。參(can)考方案見Figure 1。比如，對于(yu)1ml細胞裂解樣品，調整到0.3-0.75 M NaCl濃(nong)度，加(jia)入1000 U HL-SAN，15℃-37℃溫度條件下(xia)孵(fu)育30-60min，或者4℃過(guo)夜。Mg2+是(shi)必(bi)須的。

Figure 2. 不同樣品、不同去除要(yao)求下，HL-SAN的推薦(jian)濃度及反應條件(jian)。（DNA removal的要(yao)求是(shi)指通過瓊脂糖凝膠電泳看不(bu)到條帶。Decontamination的去除要求是對(dui)23S rDNA進行qPCR檢測為陰性(xing)。）

2. 滅活

滅活是通過添加還原劑（TCEP或DTT）來實現的，推薦用(yong)TCEP（因為TCEP在(zai)磷酸(suan)鹽溶(rong)液中不穩(wen)定，特別在(zai)中性pH下）。不(bu)同工藝流程中，通過改變孵育時間、溫度和還原劑的濃度等來滅活(huo)該酶。一(yi)般情況(kuang)下， 25-37℃反應(ying)5-10分鐘，可以滅活99%以上的酶。為了避免(mian)酶恢復活(huo)性、再(zai)次(ci)激活(huo)，保持低濃度還原劑(ji)，如0.1-0.5 mM DTT或TCEP，或延長(chang)滅(mie)活反(fan)應時間(jian)。

3. 去(qu)除

HL-SAN的pI是9.6，能(neng)夠緊(jin)密結合陽(yang)離子交換柱。在(zai)pH 9.0條件下用(yong)0.2M鹽沖(chong)洗(xi)，柱子的流出液(ye)/廢液中只有不到0.02%酶脫(tuo)落。需要注意(yi)的是，不推薦使用陰離子交換柱去除HL-SAN，因為(wei)HL-SAN的糖基(ji)化修(xiu)飾會結合到(dao)柱子上(shang)。

Figure 3. HL-SAN緊密(mi)結合在SP-sepharose柱子上(shang)（體(ti)系(xi)是0.2 M鹽(yan)濃度，pH 9.0）。

應用(yong)實(shi)例：

高效去除人體DNA (99.99%)干(gan)擾、快速檢測下(xia)呼(hu)吸(xi)道感染（LRIs）病原

呼吸道感染（RIs）病原的(de)快(kuai)速檢(jian)測一(yi)直是醫療中亟待解決的(de)問題。RIs樣本(ben)(ben)類型眾多(duo)并且病(bing)原含量(liang)差別很大(da)，同時(shi)帶有大(da)量(liang)的人體細胞，因此搭建(jian)一套(tao)快速、高(gao)效(xiao)的樣本(ben)(ben)處理系統(tong)對于通過高(gao)通量(liang)測(ce)序(xu)進行病(bing)原檢測(ce)至關重要。

2019年Nature Biotechnology文章報道了(le)如下流程(cheng)。為(wei)了(le)盡可能(neng)去除宿主DNA、提高(gao)檢測靈(ling)敏度，在優(you)化實驗(yan)的人體宿主(zhu)細胞去(qu)除、微生物DNA提取(qu)和nanopore測序等三個步驟都做了對(dui)應(ying)的優化，比(bi)如宿主DNA去(qu)除(chu)時找(zhao)到了合適濃(nong)度的saponin（2.2%），HL-SAN步(bu)驟(zou)由兩(liang)步(bu)減為一步(bu)，清洗步(bu)驟(zou)縮減為2次(ci)。從拿到樣本到建庫(ku)完成縮(suo)短至6hr，且在(zai)較終檢測中達到了(le)96.6%的敏感性和(he)100%的特(te)異性。

Figure4. Nanopore宏(hong)基因組(zu)快檢流程。

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