細(xi)胞培(pei)養物被支(zhi)(zhi)原體(ti)污染(ran)是極普遍(bian)的(de)(de)問題(ti)(ti)，面對支(zhi)(zhi)原體(ti)污染(ran)給細(xi)胞培(pei)養帶來(lai)的(de)(de)巨大難題(ti)(ti)，世(shi)界各國開始(shi)重視，并相繼建(jian)立了細(xi)胞庫，對細(xi)胞質量(liang)進展控制，效(xiao)果(guo)很好，支(zhi)(zhi)原體(ti)污染(ran)的(de)(de)問題(ti)(ti)得以(yi)限制。目前已知能污染(ran)細(xi)胞的(de)(de)支(zhi)(zhi)原體(ti)有20多種以(yi)上，其中95％以(yi)上的(de)(de)支(zhi)(zhi)原體(ti)污染(ran)是口(kou)腔支(zhi)(zhi)原體(ti)。

目前已知的主要污染(ran)源是動(dong)物血清(qing)、胰酶和(he)已污染(ran)培養物的氣溶(rong)膠，例(li)如，豬鼻支原體通(tong)過(guo)胰酶，在消化細(xi)胞時進入細(xi)胞培(pei)養物，并造成(cheng)污染。在原代細胞與傳代細胞的檢(jian)測中，原(yuan)代(dai)細胞與傳代細胞分離出支原體的(de)頻率是有明顯差(cha)異的(de)，傳代次(ci)數越多的(de)細胞，污(wu)染(ran)支原體(ti)的(de)可(ke)能(neng)性就越大，這(zhe)也是多次(ci)與動物血(xue)清、胰酶和(he)已(yi)污(wu)染(ran)培養物的(de)氣溶(rong)膠接觸后(hou)造成的(de)，在原代細(xi)胞中，污染率低(di)于4%，而傳代細胞的污染率則高(gao)達(da)57%~92%。

支原(yuan)體的(de)介紹

支原(yuan)(yuan)體(ti)是目前已知(zhi)一類能在無(wu)生命培養基(ji)上(shang)生長繁殖的(de)(de)最小的(de)(de)原(yuan)(yuan)核細胞微生物，分為(wei)兩個屬(shu)：一為(wei)支原(yuan)(yuan)體(ti)屬(shu)（Mycoplasma），有(you)幾十(shi)個種；另一為(wei)脲原(yuan)體屬(shu)（Ureaplasma），僅(jin)有一(yi)種。革蘭染色 為陰性，但(dan)不易(yi)著色，一(yi)般(ban)用(yong)Giemsa染色，染成淡紫(zi)色。                                                           

支(zhi)原(yuan)體(ti)在自然界(jie)分布廣泛，無細胞壁，直徑為(wei)0.1-0.3μm，且形態易(yi)變，極易(yi)通(tong)過除菌過濾器。大部分支(zhi)原(yuan)體(ti)繁殖(zhi)速度(du)比細菌慢，適(shi)宜生長溫度(du)為(wei)35℃，適(shi)合于偏堿條件下生存（pH7.6—8.0），

對(dui)酸(suan)耐受性差，對(dui)75%乙醇、煤酚皂溶液敏(min)感(gan)。對熱(re)比較敏感在(zai)細(xi)胞(bao)(bao)培養過程中如果在(zai)顯微鏡下發現破碎 的細(xi)胞(bao)(bao)很多(duo)，需要(yao)頻(pin)繁(fan)換液才能(neng)維持傳(chuan)代培養(yang)的時候(hou)，即應懷疑支原(yuan)體污染。細胞培養(yang)過程中遇到的支原(yuan)體95%都來(lai)自于以下四種支原(yuan)體：口(kou)腔支原(yuan)體、精氨酸支原體、豬鼻支原(yuan)體(ti)、萊氏無膽甾支(zhi)   原體， 其(qi)中萊氏無膽甾支原體(ti)為(wei)牛源性。                                                                                 

支(zhi)原體的污(wu)染來源

（1）細胞之間交叉污染；                                                         

（2）細胞培養操(cao)作人員的(de)口(kou)腔、皮膚等(deng)；                                       

（3）工作環境或實驗器材的污染；                                               

（4）培養基(ji)的污染。                                                      

支(zhi)原(yuan)體(ti)污染示例圖

支原體污染的(de)嚴重性

（1）細胞(bao)外(wai)形(xing)可以沒有(you)明顯的變化(hua)，支原體(ti)(ti)可以與細胞(bao)共存，污(wu)染后細胞(bao)液不(bu)(bu)會死亡，培(pei)養(yang)基一般不(bu)(bu)發生(sheng)渾濁；                                                                 

（2）使用被支原(yuan)體污染的細(xi)胞做實驗會嚴(yan)重影響(xiang)實驗的結果，因為支原(yuan)體會抑制細(xi)胞生長；導致染色   體畸變；細(xi)胞膜抗原(yuan)性改變；細(xi)胞復(fu)蘇后(hou)存活率降低等。     

（3）影響(xiang)細胞(bao)的代謝(xie)和(he)功能：培液中的精(jing)氨酸被支原體(ti)大量消耗，引起細胞(bao)蛋(dan)白質、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體(ti)活動使培液成分發生改變（如發酵(jiao)型支原體降解糖類產生酸性物質），影響細胞代謝。

（4）培養(yang)過(guo)程中(zhong)細胞破碎較多，培養(yang)基(ji)pH變化明顯，需要頻繁(fan)更換新鮮培養(yang)基(ji)；       

（5）細胞被支原體污染(ran)后會形成(cheng)共生體系導(dao)致污染(ran)不斷擴大。               

支原(yuan)體污染的檢測及鑒定(ding)方法：

01

分離(li)培養法

支原體(ti)的病原學(xue)檢測主要是從被污染的細胞、雞胚中分離培養出支原(yuan)體(ti)來確定(ding)，分離(li)培養(yang)法(fa)是檢(jian)(jian)測(ce)支(zhi)原體污染中最為可靠準確的方法(fa)。但是支(zhi)原體對環境的影響敏感，容易被(bei)滅活，而且分離(li)培養(yang)操作相對繁瑣，所需時間較長，因此只(zhi)能夠對支(zhi)原體污染進行定(ding)性(xing)觀察。分離(li)培養(yang)法(fa)在常規的支(zhi)原體檢(jian)(jian)測(ce)中多用于輔助其它檢(jian)(jian)測(ce)方法(fa)。                                                                                                     

02

DNA熒(ying)光(guang)染(ran)色法

DNA熒光染色法較分(fen)離培養法縮短了(le)檢測周期，主要用于細(xi)胞培養中污染支原體的檢測。DNA熒光染色法正是(shi)利用熒光染(ran)色劑雙苯咪唑（Bisbenzimidzole）Hoechst33258能夠結合支(zhi)原(yuan)體(ti)(ti)DNA中的A-T堿基(ji)富集(ji)區域(yu)的原(yuan)理，被支(zhi)原(yuan)體(ti)(ti)污染(ran)的細胞(bao)經染(ran)色(se)后，其細胞(bao)核(he)外(wai)與(yu)細胞(bao)周圍可看到許多大小均(jun)一(yi)的熒光點，即(ji)是富(fu)含(han)A-T堿(jian)基(ji)區域的支原體DNA。                                                                   

03

PCR技術

PCR作為一種(zhong)快速、靈敏、特異(yi)且簡便的(de)(de)基因診斷技術已應用于(yu)科學(xue)研究和疾病的(de)(de)診斷。根(gen)據支原體基因組內(nei)的(de)(de)保守序(xu)列設計特異(yi)引物，對待(dai)檢樣品的(de)(de)核(he)酸進行擴增(zeng)，通過對擴增(zeng)產物的(de)(de)大(da)小(xiao)分析作出診斷。PCR檢測技術(shu)用于支原(yuan)體(ti)污染(ran)的檢測，周(zhou)期短、靈(ling)敏度高(gao)、特(te)異性好、操作(zuo)簡(jian)單且(qie)一次可檢測大量(liang)樣品。                                                                                                                               

04

酶聯(lian)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA用于(yu)支(zhi)原體污(wu)染的檢測(ce)中(zhong)，有著良好(hao)的特(te)異性和敏感(gan)性，一次可以(yi)完成大量樣品的檢測(ce)。如今已有LONZA等(deng)公(gong)司開(kai)發了(le)針對細胞中(zhong)污(wu)染支(zhi)原體的檢測(ce)試劑(ji)盒，具(ju)有簡便、快速與定(ding)量定(ding)性檢測(ce)等(deng)特(te)點。                                                                                                                                 

05

電鏡

一(yi)般在細胞(bao)培養48～72小(xiao)時，細胞(bao)接近匯合前，用胰酶(mei)消化細胞(bao)制成細胞(bao)懸液后進(jin)行固定、包埋(mai)、切片后才能進(jin)行觀察(cha)。                                                                                                 

06

定期(qi)檢測(ce)

支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)感染(ran)會(hui)使(shi)培養(yang)細(xi)胞慢(man)慢(man)枯萎，因此對培養(yang)細(xi)胞定(ding)期進行支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)檢(jian)測(ce)非常重要。一般來說每1至3個月就(jiu)應該進行一次支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)檢(jian)測(ce)。將(jiang)定(ding)期支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)檢(jian)測(ce)常規化堅持下(xia)去，是細(xi)胞培養(yang)實(shi)驗室(shi)應對支(zhi)(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)(ti)感染(ran)的關鍵。                                                                                                                     

細胞(bao)污染(ran)支(zhi)原(yuan)體的預防(fang)

細胞(bao)培養工(gong)作中，主(zhu)要從(cong)以(yi)下(xia)幾個方面來預防支原體的污染(ran)：                                           

1）控制環境(jing)污染                                                           

2）嚴格實驗操作                                                                   

3）細胞培養基(ji)和器材(cai)要保證無菌                                                    

4）在細胞培養基中(zhong)加入(ru)適量的抗生素                                               

　　支(zhi)原(yuan)體污染細胞(bao)后，有必要清除支(zhi)原(yuan)體，常用方法有：                         ;

1）對于非重要(yao)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)，如培(pei)養中的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)、WCB的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)等，將培(pei)養物(wu)與用過的(de)(de)(de)培(pei)養基滅活后丟棄即可。對于較為重要(yao)的(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)，如來源(yuan)珍(zhen)貴或實驗室中細(xi)(xi)胞(bao)保藏量較小(xiao)等可以(yi)采用以(yi)下（2）-（8）的(de)(de)(de)方法。                                                             

2）用MRA處理：用支原體(ti)清(qing)除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，作用濃度為  25μg/ml，兩周可以(yi)清(qing)除支原體(ti)。                             

3）用(yong)清洗純化(hua)法清除支原體(ti)污染的(de)方(fang)法：細(xi)(xi)胞營養馴化(hua)→優(you)質(zhi)細(xi)(xi)胞群的(de)篩選→細(xi)(xi)胞清洗→反復離(li)心洗滌，其原理(li)是利(li)用(yong)離(li)心力、細(xi)(xi)胞、微生物質(zhi)量(liang)和(he)懸液的(de)浮力差達到清(qing)除(chu)支原體的(de)目的(de)。由于(yu)支原體個體小且除發(fa)酵支原體外多為細胞(bao)外寄生,所以通過反(fan)復洗滌細胞(bao)和低速離心換液(ye)使其中潛(qian)在的(de)(de)支原(yuan)體(ti)數量降(jiang)低至很(hen)少. 如(ru)結合敏感抗生(sheng)素的(de)(de)抑殺(sha)作用，可達到更好(hao)的(de)(de)效(xiao)果。                                         

4）藥(yao)物輔助加溫處理：先用(yong)藥(yao)物處理后，再將(jiang)污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞(bao)有(you)不良影(ying)響。                                           

5）使用支原體(ti)特(te)異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可(ke)去除(chu)支原體污染，因特異抗(kang)體可(ke)抑(yi)制支原體生長，故經抗(kang)血清處理后(hou)11天即轉為陰(yin)性(xing)(xing)，并且5個月后(hou)仍為陰(yin)性(xing)(xing)。                     

6）動物體內接(jie)種除菌法(fa)：把受支原體污染的腫瘤(liu)細胞(bao)接種(zhong)(zhong)在同種(zhong)(zhong)動(dong)物(wu)(wu)皮(pi)下或(huo)腹腔中，借動(dong)物(wu)(wu)免疫系統消滅支原(yuan)體(ti)，而腫瘤(liu)細胞(bao)卻能(neng)在體(ti)內繼續生長，待一(yi)定時間后(hou)，從體(ti)內取出細胞(bao)再進(jin)行(xing)培養(yang)繁殖。     

7）巨噬細(xi)胞吞噬法(fa)：從動物(wu)腹腔(qiang)采取(qu)巨噬細(xi)胞，為排除其(qi)它細(xi)胞成分，可先進行純化，然后再(zai)加入被(bei)支(zhi)原(yuan)體污染的細(xi)胞培(pei)(pei)養(yang)液(ye)中混(hun)合(he)培(pei)(pei)養(yang)。在培(pei)(pei)養(yang)過程(cheng)中，為檢查支(zhi)原(yuan)體是否已(yi)被(bei)消除干凈，可利用支(zhi)持物(wu)培(pei)(pei)養(yang)法(fa)驗證(zheng)，取(qu)出支(zhi)持物(wu)逐(zhu)日染色、鏡檢觀(guan)察(cha)，至支原體已被消除干凈為(wei)止。                                 

8）使用支(zhi)原體清除(chu)培(pei)養基(ji)，每(mei)2~3天更換1次新鮮(xian)培(pei)養液，換(huan)液時用(yong)無菌的(de)(de)平衡(heng)鹽溶液洗滌細(xi)(xi)胞(bao)1~2次；期間如(ru)果(guo)細(xi)(xi)胞(bao)密度過大，請(qing)保(bao)持細(xi)(xi)胞(bao)密度適當（貼(tie)壁細(xi)(xi)胞(bao)可(ke)能需要用(yong)胰酶(mei)消化），并更(geng)換新的(de)(de)培養器皿，3天之后(hou)，即(ji)可(ke)見明顯(xian)清除效(xiao)果(guo)；處理15天后(hou)，可(ke)以用(yong)支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)檢(jian)測試劑(ji)盒(he)進行檢(jian)測，檢(jian)測支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)是否殺滅全部；如(ru)果(guo)仍(reng)有(you)支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)殘留，可(ke)以考慮再處理6天；為避免細(xi)(xi)胞(bao)再次受到“支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)"的(de)(de)污染(ran)，以后(hou)每隔(ge)1個月進行支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)常規檢(jian)測，以保(bao)證沒有(you)新的(de)(de)支(zhi)原體(ti)(ti)(ti)污染(ran)。                                           

注：支原體污染時(shi)(shi)(shi)細胞表現(xian)為長(chang)(chang)得不好(hao)，也(ye)不死亡(wang)，同(tong)時(shi)(shi)(shi)，培養基(ji)(ji)又是清(qing)亮的，時(shi)(shi)(shi)間長(chang)(chang)達一(yi)周也(ye)沒有什么(me)變化(hua)，這時(shi)(shi)(shi)基(ji)(ji)本上可以判(pan)斷出是支原體污染了。