今天將為(wei)大家介紹的(de)是手工細胞(bao)計數(shu)法。因為(wei)在細胞(bao)培(pei)養(yang)技術中(zhong)，細胞(bao)計數(shu)應是一(yi)項基本(ben)功(gong)，對于標(biao)準(zhun)化培(pei)養(yang)條件以及需要精確定量的(de)實驗來說都(dou)非常(chang)關鍵。

下(xia)面即是手工細胞計(ji)數的基本流(liu)程、原理和意義：

1.計數(shu)前(qian)首先準備(bei)好細胞計數(shu)器(qi)（血球計數(shu)板）：

使用70%乙醇將蓋玻片和細胞計數板清潔、晾干備用。
將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細胞計數器上。

（注：使用前須保證蓋玻片和計數板已充分晾干，否則將影響后續細胞充池及計數結果。）

2.制備細胞(bao)懸液：

對于貼壁生長的(de)(de)細胞，我們需要首先使(shi)用胰酶消(xiao)化的(de)(de)方(fang)法使(shi)細胞從培養皿表面脫落(luo)。（懸浮細胞則無需消(xiao)化，稀釋(shi)到合(he)適(shi)倍數即(ji)可(ke)。）

然后(hou)加(jia)入適(shi)當的(de)含血清(qing)培養基，中和胰酶的(de)作(zuo)用(yong)并重懸(xuan)細胞，以得(de)到(dao)均質的(de)細胞懸(xuan)液(ye)。要求(qiu)盡可(ke)(ke)能將細胞吹散，不要殘留任(ren)何細胞團(tuan)，但(dan)不可(ke)(ke)用(yong)力過大。

（注：消化太過或消化不全均會使計數結果產生偏差。）

臺盼蘭染色（可選）：
如果需要計算細胞的活率，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合；

室溫孵育3-5分鐘（懸浮細胞染色時間可視情況適當延長），使臺盼蘭全部進入死細胞，使死細胞著藍色。

3.充池：即血細胞計數器加樣

使用吸管或移液器將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到計數池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池，此即為充池。

（注：若需進行多個樣品的計數，應盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。）

以同樣的方式在另一側的計數池中也加入計數樣品。

將計數板靜置幾分鐘使細胞擴散、沉降。

4. 細胞(bao)計數：

在100倍顯微鏡下，移動計數板將視野對準計數板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網格。中央方塊區差不多剛好可以填滿整個視野（圖1中標記的3號位置）。

                     圖(tu)1.細胞計數板圖(tu)解

分(fen)別計(ji)數(shu)大方(fang)格(ge)1.2.4.5中的細胞(bao)數(shu)。（為(wei)(wei)降低計(ji)數(shu)誤(wu)差，最好將細胞(bao)濃度調(diao)整(zheng)為(wei)(wei)20-50個(ge)/大方(fang)格(ge)。）并重復記錄(lu)另一側計(ji)數(shu)池中的細胞(bao)數(shu)，總計(ji)8個(ge)大方(fang)塊(kuai)，然后取均值。

計數原則為(wei)：“數上不(bu)數下，數左不(bu)數右(you)"。（判斷標準為(wei)是否接觸三條邊線的中間線，如圖2所示）。

                                      圖2. 細(xi)胞計(ji)數(shu)原(yuan)則

如果有多個細胞沒有吹散而成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數細胞為單個細胞。

5. 細胞濃度計算：

                                             圖(tu)3. 樣(yang)品充池(chi)體積圖(tu)解

由圖3可以得出，每個大(da)方格的(de)容(rong)積(ji)為：

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每個大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細胞數時需乘以104。

在常規沒有使用臺盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升樣品中細胞的個數：
每毫升樣品中細胞的個數 = 每個大方格內細胞的平均數 × 細胞稀釋倍數×104

如果使用了臺盼蘭染色，還需要計算活細胞的百分率：
活細胞百分率（%）= 臺盼蘭拒染細胞數/總細胞數×100

此時活細胞數的計算公式為：
每毫升樣品中活細胞的個數 = 每個大方格中細胞的平均數×活細胞比率×細胞稀釋倍數×2×104
注：乘2是由于在臺盼蘭染色時，進行了等體積混合，相當于稀釋了一倍。

看了(le)(le)以(yi)上步驟(zou)和原理，大家不(bu)禁(jin)會問：我們為什么要(yao)數細(xi)胞(bao)(bao)啊？細(xi)胞(bao)(bao)計(ji)數究(jiu)竟有(you)什么意義呢？其(qi)實，當我們想(xiang)了(le)(le)解細(xi)胞(bao)(bao)的(de)生(sheng)長(chang)情況時(shi)，除了(le)(le)直接觀察細(xi)胞(bao)(bao)形態以(yi)外，繪制細(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)長(chang)曲線(xian)、計(ji)算細(xi)胞(bao)(bao)倍(bei)增時(shi)間應該(gai)就是(shi)廣泛采(cai)用的(de)評價指標了(le)(le)。

所以盡管(guan)使(shi)用血細(xi)胞計數(shu)(shu)板手工計數(shu)(shu)細(xi)胞過(guo)程十分繁瑣，對實驗者操作者的(de)(de)(de)(de)要求(qiu)也比較嚴格，現在也已有很多自動化(hua)的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞計數(shu)(shu)器/儀，但對于科學(xue)研(yan)究(jiu)中遇到的(de)(de)(de)(de)各種(zhong)細(xi)胞而言，手工計數(shu)(shu)仍然是(shi)易行的(de)(de)(de)(de)方法(fa)而被廣(guang)大實驗室采用。

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