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CRISPR/Cas9 系統是當下很流行的基因編輯工具，在基礎研究和臨床轉化中展現日益強大的實力。CRISPR/Cas9 系統由 Cas9 蛋白和單鏈向導 RNA（sgRNA）組成。Cas9 蛋(dan)白在(zai) sgRNA 的引導下(xia)識別特定(ding)的 DNA 序列，進行雙鏈 DNA 切割。因此 CRISPR/Cas9 要實現對目標序列的切割，必須經過兩重的考驗，一是 sgRNA 和靶 DNA 之間堿基配對，二是靶 DNA 的 3' 端有合適的 PAM 序列。以 SpCas9 為例，其僅能識別編輯 PAM 序列為 NGG 的基因組位點，因而限制了其應用，研究者們一直在嘗試優化 Cas9 蛋白，以拓展其對不同 PAM 序列的兼容性。
Cas9 強(qiang)勢升級-EnGen® SpRY Cas9 核酸酶，基本不受 PAM 序(xu)列限制，想(xiang)剪哪(na)里剪哪(na)里 EnGen® SpRY Cas9 核(he)酸(suan)酶克隆自(zi)化膿鏈(lian)球菌（Streptococcus pyogenes），是(shi)一種經過改造的(de)(de) DNA 內(nei)切(qie)酶，可在(zai)靶向(xiang)(xiang)位點(dian)特異切(qie)割(ge)(ge)雙鏈(lian) DNA。其靶向(xiang)(xiang)切(qie)割(ge)(ge)需(xu)要一個大約(yue) 100 nt sgRNA，sgRNA 與雙鏈(lian) DNA 底(di)物的(de)(de) PAM 序列(lie)上游緊鄰的(de)(de) 20 個核(he)苷(gan)酸(suan)區域(yu)互(hu)補。與野生型 Spy Cas9 的(de)(de)經典 5′-NGG-3′ PAM 不(bu)同，SpRY Cas9 在(zai)體外靶向(xiang)(xiang)切(qie)割(ge)(ge)基本上對 PAM 沒(mei)有(you)序列(lie)要求，只需(xu)要一個 5′-NNN-3′(1,2) PAM，在(zai) PAM 上游 3 個核(he)苷(gan)酸(suan)處進行雙鏈(lian)切(qie)割(ge)(ge)。EnGen SpRY Cas9 在(zai)其編碼蛋白(bai)的(de)(de) C 端帶有(you) SV40（Simian virus 40）T 抗原核(he)定(ding)位序列(lie)（NLS）。 優勢一 使用非特異性 PAM（5′-NNN-3′ PAM），消除對雙鏈(lian) DNA 靶向切割的序列限制 優勢二 在克隆工作(zuo)流程中成功用于消化(hua)大(da)片段質粒(li) 優勢三 可與(yu) EnGen sgRNA 合成(cheng)試劑(ji)盒(he) S.pyogenes (NEB #E3322)， EnGen 突變檢測試劑(ji)盒(he)（NEB #E3321）和 NEBuilder® 高(gao)保(bao)真 DNA 組裝(zhuang)預(yu)混液（NEB #E2621）聯合使用(yong) EnGen SpRY Cas9 核酸酶是來自 S. pyogenes的 Cas9 核酸酶的變體，其 PAM 作用結構域內有幾個點突變（1）。與野生型 Cas9 不同，EnGen SpRY Cas9 不受 NGG PAM 的限制，在體外應用中可以在任意三核苷酸序列上游進行雙鏈切割。 EnGen® SpRY Cas9 切(qie)(qie)(qie)(qie)割靈活(huo)性的(de)(de)演示(shi)(shi)。A）pXba 的(de)(de)示(shi)(shi)意圖(tu)，顯示(shi)(shi)了限制性內切(qie)(qie)(qie)(qie)酶 BsrGI 識別位點(dian)(dian)。矩(ju)形框(kuang)中(zhong)包(bao)含(han)了 BsrGI 識別序(xu)列(lie)，紅(hong)色三(san)角形表(biao)示(shi)(shi)切(qie)(qie)(qie)(qie)割位點(dian)(dian)。B）用(yong)于(yu)靶向 pXba 中(zhong) BsrGI 位點(dian)(dian)的(de)(de)三(san)個(ge) sgRNA 序(xu)列(lie)。EnGen SpRY Cas9 和(he) BsrGI 的(de)(de)切(qie)(qie)(qie)(qie)割位點(dian)(dian)均以(yi)紅(hong)色三(san)角指示(shi)(shi)。SpRY Cas9 非(fei)經典 PAMs 以(yi)黃色文(wen)本(ben)表(biao)示(shi)(shi)。C）在(zai) 1X NEBuffer r3.1 中(zhong)，使用(yong) 10 units BsrGI 或 1µM EnGen SpRY Cas9 和(he)上(shang)述三(san)種 sgRNA（濃度均為(wei)1µM）消化(hua) 1µg pXba 質粒(li)(li)(li)（22563 bp）。所(suo)有反應在(zai) 37°C下(xia)溫育 1 小(xiao)(xiao)時，然后在(zai) 80°C下(xia)溫育 5 分鐘(zhong)。通過使用(yong) Agilent gDNA ScreenTape 系統在(zai) 4200 TapeStation 儀(yi)器上(shang)進(jin)行(xing)凝膠電泳(yong)，以(yi)比較 BsrGI 和(he) SpRY 消化(hua)后產(chan)(chan)物 DNA 條帶(dai)。針對 pXba 質粒(li)(li)(li)的(de)(de) BsrGI 位點(dian)(dian)進(jin)行(xing)定(ding)點(dian)(dian)切(qie)(qie)(qie)(qie)割， BsrGI 和(he) SpRYCas9 切(qie)(qie)(qie)(qie)割產(chan)(chan)生了幾(ji)乎一致的(de)(de)條帶(dai)圖(tu)譜。使用(yong)濃度低至 50 nM 的(de)(de) EnGen SpRY Cas9 和(he) sgRNA對 1µg pXba 質粒(li)(li)(li)進(jin)行(xing)消化(hua)，結果與(yu)濃度 1 µM 的(de)(de)相似。未酶切(qie)(qie)(qie)(qie)的(de)(de) pXba 作為(wei)對照(zhao)進(jin)行(xing)電泳(yong)，但是環狀 DNA 在(zai) gDNA ScreenTape 系統中(zhong)電泳(yong)不能精確地按大(da)小(xiao)(xiao)進(jin)行(xing)分離(li)。 在 1X NEBuffer™ r3.1 中，使用 50 nM 的 EnGen SpRY Cas9 和 50 nM 的 sgRNA，在37°C下反應 1 小時，將 1 µg pXba（22,563 bp）在 pVII ORF 起始密碼子的下游進行線性化。在繼續 DNA 組裝之前，線性化質粒可以選擇經過柱純化或不純化。按照推薦方案，使用 NEBuilder 高保真 DNA 組裝試劑盒將編碼核定位信號（NLS）標簽的寡核苷酸插入到pVII中。通過轉化后生長的克隆數量，可以定性評估在 EnGen SpRY Cas9 消化質粒后，有多少轉化子來自未消化的質粒。雖然不是必需的，但在組裝前對線性化的 pXba 質粒進行純化可以減少背景菌落百分比。 產品名稱 貨號 規格 EnGen® SpRY Cas9 核酸(suan)酶 M0669T/M 500/2,500 pmol
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