蛋(dan)白(bai)不表達或表達量很低？

1、選(xuan)擇正確的表達(da)載體與表達(da)菌株

• T7啟(qi)(qi)動子(zi)的(de)載體(如pET系列(lie)載體)應選(xuan)用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等(deng)菌(jun)株。非T7啟(qi)(qi)動子(zi)的(de)表達載體 (如Tac啟(qi)(qi)動子(zi)的(de)pGEX、pMAL系列(lie)表達載體) 應選(xuan)用BL21表達菌(jun)株。

• 對細胞有毒性的蛋白，建議選用背景表達低、嚴謹調控誘導的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。

• 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白，建議選用Transetta(DE3) 等菌株。

2、嘗試不同的表(biao)達載體(ti)與菌(jun)株

   不(bu)(bu)同(tong)(tong)的蛋白，對不(bu)(bu)同(tong)(tong)載(zai)體與菌株(zhu)的偏好不(bu)(bu)同(tong)(tong)，如果某一蛋白無法通過優化誘導表達條件(jian)得到明顯改善，可以更換其它菌株(zhu)或表達載(zai)體。

3、表達(da)條件(jian)的(de)優化

• 選擇不同的培(pei)養基(ji)(ji)。對(dui)于某些蛋白，在培(pei)養基(ji)(ji)中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明顯提高(gao)表達量。

• 較高(gao)的(de)(de)(de)溫度(du)、較高(gao)的(de)(de)(de)誘導物濃度(du)、較長(chang)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達時間，一般可以加快表(biao)(biao)達的(de)(de)(de)速度(du)，促進目的(de)(de)(de)蛋白的(de)(de)(de)積累，從而(er)提高(gao)表(biao)(biao)達量。但可能(neng)會(hui)降低可溶(rong)蛋白的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達量，形成包(bao)涵體。

• 細胞的生長狀態對(dui)蛋白表達有很(hen)大的影響，可以通過測量菌液的OD600值監測生長狀態。對(dui)于大部分蛋白，應在菌株的對(dui)數(shu)生長期(qi)(OD600=0.5) 進行誘導(dao)。

目的蛋白不可溶，形成(cheng)包涵(han)體？

首(shou)先確認目的蛋白是否有表達。

• 裂解菌(jun)體并(bing)離(li)心后，通過對全菌(jun)、上清、沉淀的(de)檢測，確認目(mu)的(de)蛋白是否(fou)表達，是否(fou)形成了包涵(han)體。

• 包涵體的(de)(de)形成與蛋白(bai)自(zi)身結構、表達系(xi)統(tong)、誘導表達條件等因素有著密切關系(xi)。在無法改變蛋白(bai)自(zi)身結構的(de)(de)情況下，可以嘗試(shi)不同的(de)(de)表達載體與菌株，增強其溶解能力，優化出適合特定蛋白(bai)的(de)(de)表達系(xi)統(tong)。

• 目前認為(wei)包涵體(ti)的(de)形(xing)成是由于蛋(dan)白(bai)在細胞(bao)內積累(lei)速度(du)(du)過(guo)快，沒(mei)有正確折疊而聚集沉淀。可(ke)以通過(guo)優化誘(you)導(dao)(dao)(dao)(dao)表達(da)條件，如(ru)降低誘(you)導(dao)(dao)(dao)(dao)溫度(du)(du)、降低誘(you)導(dao)(dao)(dao)(dao)物(wu)濃度(du)(du)、縮短表達(da)時(shi)間、降低誘(you)導(dao)(dao)(dao)(dao)時(shi)菌(jun)液的(de)OD值等，以減(jian)緩(huan)蛋(dan)白(bai)的(de)積累(lei)。

目的(de)蛋(dan)白(bai)大小不正確？

• 蛋(dan)白(bai)的結構對判(pan)斷分子(zi)(zi)量(liang)大小(xiao)有一(yi)定影響。可以通過加(jia)熱變(bian)性蛋(dan)白(bai)，從(cong)而準確判(pan)斷蛋(dan)白(bai)分子(zi)(zi)量(liang)大小(xiao)。

• 確認蛋(dan)白(bai)表達(da)是(shi)否完整，蛋(dan)白(bai)是(shi)否提前終止(zhi)表達(da)。

• 若(ruo)形成二聚體甚至多聚體，可以通(tong)過加熱(re)變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等(deng)還原劑) 等(deng)手段，破壞次級結構，準確判斷(duan)分子量大(da)小。

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