將克(ke)隆(long)化(hua)基因插(cha)入合適載體后導入大(da)腸(chang)桿菌用(yong)于表(biao)達(da)大(da)量蛋白質的方法(fa)一般稱(cheng)為原核表(biao)達(da)。這種方法(fa)在蛋白純(chun)化(hua)、定位(wei)及(ji)功(gong)能(neng)分析等(deng)方面都有應(ying)用(yong)。大(da)腸(chang)桿菌用(yong)于表(biao)達(da)重(zhong)組蛋白有以下特點：

易(yi)于(yu)生長和控(kong)制；用于(yu)細菌(jun)培養的(de)(de)材料(liao)不及(ji)(ji)哺(bu)乳(ru)動物(wu)細胞(bao)系(xi)統的(de)(de)材料(liao)昂貴；有各(ge)(ge)種(zhong)各(ge)(ge)樣(yang)的(de)(de)大(da)腸桿菌(jun)菌(jun)株及(ji)(ji)與之(zhi)匹(pi)配的(de)(de)具(ju)各(ge)(ge)種(zhong)特性(xing)的(de)(de)質粒可供選擇。但是，在(zai)大(da)腸桿菌(jun)中表達的(de)(de)蛋白由于(yu)缺(que)少修飾和糖基(ji)化(hua)、磷酸(suan)化(hua)等翻譯后加工(gong)，常形成包涵體而影響表達蛋白的(de)(de)生物(wu)學活性(xing)及(ji)(ji)構(gou)象。

表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：

（1）選擇(ze)標志的編(bian)碼序列；

（2）可控轉錄的(de)啟動(dong)子；

（3）轉錄(lu)調控序列(lie)(轉錄(lu)終(zhong)止(zhi)子，核(he)糖體結合位(wei)點(dian))；

（4）一個多限制酶切(qie)位點(dian)接頭；

（5）宿主體內自主復制的序列(lie)。

原核表達一般程序如下：

獲得目的基因(yin)－準備表(biao)(biao)達載體－將目的基因(yin)插入表(biao)(biao)達載體中（測序驗(yan)證）－轉化表(biao)(biao)達宿主(zhu)菌(jun)－誘導靶蛋白的表(biao)(biao)達－表(biao)(biao)達蛋白的分析(xi)－擴增、純化、進一步檢測

一、試劑準備

1、LB培養基。

2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D^-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH₂O中，0.22μm濾(lv)膜抽(chou)濾(lv)，-20℃保存。

二、操作步驟

（一）獲得目的基因

1、通過PCR方法：以(yi)含目的基(ji)因的克隆(long)質粒為模板，按基(ji)因序(xu)列設計一(yi)對引(yin)物（在(zai)上游和下游引(yin)物分別引(yin)入不同的酶切位點），PCR循環獲(huo)得所(suo)需基(ji)因片段。

2、通過RT-PCR方法(fa)(fa)：用TRIzol法(fa)(fa)從(cong)細胞(bao)或組(zu)織中提取總(zong)RNA，以(yi)(yi)mRNA為模板(ban)，逆轉(zhuan)錄形成(cheng)cDNA第yi鏈(lian)，以(yi)(yi)逆轉(zhuan)錄產物(wu)(wu)為模板(ban)進(jin)行PCR循環獲(huo)得(de)產物(wu)(wu)。

（二）構建重組表達載體

1、載體酶切(qie)(qie)：將表(biao)達質粒用(yong)限制性內切(qie)(qie)酶（同引物(wu)的(de)酶切(qie)(qie)位點）進行雙酶切(qie)(qie)，酶切(qie)(qie)產(chan)物(wu)行瓊脂糖電泳后，用(yong)膠回(hui)(hui)收Kit或(huo)凍融法回(hui)(hui)收載體大片段。

2、PCR產物雙酶(mei)切后回收，在T4DNA連接(jie)(jie)酶(mei)作用下連接(jie)(jie)入載體。

（三）獲得含(han)重組表達質(zhi)粒的表達菌種

1、將連接產物轉化大(da)腸(chang)桿菌(jun)DH5α，根據(ju)重組(zu)載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選(xuan)，挑取單斑，堿(jian)裂解法小量(liang)抽提質粒，雙酶(mei)切初步鑒定。

2、測序驗證目的基因的插入方向及閱(yue)讀(du)框架均(jun)正確，進入下步(bu)操作。否(fou)則應篩選更多克隆，重復(fu)亞(ya)克隆或亞(ya)克隆至不同(tong)酶切位點。

3、以此(ci)重組質粒DNA轉化表達宿(su)主菌的感受(shou)態(tai)細胞。

（四）誘導表達

1、挑取含重(zhong)組質粒的菌體單斑至(zhi)2ml LB（含Amp50μg/ml）中(zhong)37℃過夜培養(yang)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中，37℃震蕩培養至OD₆₀₀ ≌0.4-1.0（OD600 0.6，大約(yue)需3hr）。

3、取(qu)部分(fen)液體作(zuo)為未誘導的(de)對照組(zu)，余下的(de)加入IPTG誘導劑至(zhi)終濃度0.4mM作(zuo)為實驗組(zu)，兩組(zu)繼續(xu)37℃震蕩培養3hr。

4、分別取菌體(ti)1ml，離(li)心12000g×30s收獲(huo)沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻，70℃10min。

5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可(ke)做SDS-PAGE等分(fen)析(xi)。

三、注意事項

1、選擇(ze)(ze)表達(da)(da)載體時，要(yao)根據(ju)所表達(da)(da)蛋(dan)白(bai)的(de)終應(ying)用考慮。如為方便純(chun)化，可(ke)選擇(ze)(ze)融(rong)合(he)表達(da)(da)；如為獲得天然蛋(dan)白(bai)，可(ke)選擇(ze)(ze)非融(rong)合(he)表達(da)(da)。

2、融合表達時在選擇外(wai)源DNA同載體分子連接反應時，對轉錄(lu)和轉譯過程(cheng)中密碼(ma)結構(gou)的閱讀不能發生干擾。