生物(wu)醫學科(ke)研(yan)工作者的科(ke)研(yan)基本離(li)不開抗體(ti)(ti)，WB（western blot）,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 免疫組化),IF(immunofluorescence 免疫熒光),ChIP(Chromatin immunoprecipitation)，FC(flowcytometry 流(liu)式(shi)細胞(bao)) 都(dou)需要(yao)用到抗體(ti)，那么(me)這幾種實(shi)驗方法中的抗體(ti)有什么(me)區別(bie)呢？

我們在(zai)CST上面找(zhao)p53的(de)抗(kang)體，得到了如(ru)下的(de)頁面

可以(yi)看出(chu)p53抗(kang)體(ti)有(you)很多種(zhong)，并且每種(zhong)抗(kang)體(ti)能做的(de)實(shi)驗還都(dou)不一樣，那么為(wei)什么不同(tong)的(de)抗(kang)體(ti)能做的(de)實(shi)驗不一樣呢？這要從抗(kang)體(ti)是如何制備的(de)開(kai)始。

1. 如何(he)才能成為(wei)一(yi)個優秀的抗原？

制備(bei)(bei)抗體(ti)之前(qian)最重(zhong)要的(de)是如(ru)何制備(bei)(bei)抗原(yuan)。一(yi)個良好即優秀的(de)抗原(yuan)應該具備(bei)(bei)的(de)素質(zhi)是

a. 分子足夠大(da)。 我們(men)知(zhi)道抗原與(yu)抗原之間的區(qu)別是由抗原決(jue)定族決(jue)定的，抗原決(jue)定族又叫做表位(wei)（epitope），這些表(biao)位通常(chang)是由6-8個(ge)氨基酸組成(cheng)的。而且要5-10kD才有(you)一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)表位(wei)(wei)(wei)，所以一(yi)(yi)(yi)些分子量太小(xiao)的(de)蛋白質(zhi)或者多肽(tai)很難(nan)有(you)一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)表位(wei)(wei)(wei)的(de)，也(ye)很難(nan)作為(wei)一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)合(he)格優(you)秀的(de)抗原。注意表位(wei)(wei)(wei)有(you)兩種(zhong)形式(shi)，一(yi)(yi)(yi)種(zhong)是線性表位(wei)(wei)(wei)，即由氨基(ji)酸(suan)的(de)序列決(jue)定的(de)。另外一(yi)(yi)(yi)種(zhong)是構象表位(wei)(wei)(wei)，是由氨基(ji)酸(suan)的(de)空間(jian)結(jie)構決(jue)定的(de)。兩個(ge)(ge)相(xiang)隔很遠的(de)氨基(ji)酸(suan)序列在空間(jian)結(jie)構上靠(kao)在一(yi)(yi)(yi)起可以形成一(yi)(yi)(yi)個(ge)(ge)結(jie)構表位(wei)(wei)(wei)。

b. 外源性強。我們常(chang)常(chang)將抗原(yuan)(yuan)注射到(dao)(dao)(dao)動物(wu)內體(ti)得到(dao)(dao)(dao)抗體(ti)，因(yin)此抗原(yuan)(yuan)必須要與該動物(wu)體(ti)內的(de)(de)成分區(qu)別性大，因(yin)為動物(wu)對自身的(de)(de)物(wu)質形成了免疫耐受(shou)，如果抗原(yuan)(yuan)與動物(wu)自身的(de)(de)物(wu)質非(fei)常(chang)相似(si)，則(ze)很難(nan)引起強烈(lie)的(de)(de)免疫應答，也很難(nan)得到(dao)(dao)(dao)好(hao)的(de)(de)抗體(ti)。

c. 結構盡量復雜(za)。有(you)些物質即(ji)使分子量很大也不能算是一(yi)個合格(ge)的(de)(de)抗(kang)原，比如明(ming)膠(jiao)分子量特別大，也屬(shu)于外(wai)源性強的(de)(de)物質。但是明(ming)膠(jiao)的(de)(de)氨基酸(suan)(suan)(suan)(suan)基本上是直鏈(lian)的(de)(de)氨基酸(suan)(suan)(suan)(suan)，在體(ti)內容易被(bei)降解，類似(si)的(de)(de)淀(dian)粉、核酸(suan)(suan)(suan)(suan)、多聚賴氨酸(suan)(suan)(suan)(suan)也是一(yi)樣，不是一(yi)個合格(ge)的(de)(de)抗(kang)原。

2. 制備抗體中常用獲(huo)得抗原的方(fang)式有哪些？

a. 人工合成多肽(tai)。很多家(jia)族蛋(dan)白(bai)相似度(du)很高，比如actin家族(zu)中 a-actin, b-actin, r-actin三者之間非常相似(si)，基本上只(zhi)差幾個(ge)氨(an)基酸，而這些差別(bie)的(de)(de)(de)(de)氨(an)基酸往(wang)往(wang)還被包裹在內部(bu)。因此只(zhi)有人工合成這些差別(bie)的(de)(de)(de)(de)序(xu)列多肽，才可能(neng)區分(fen)(fen)開這三種(zhong)相似(si)的(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)質。制備出來(lai)的(de)(de)(de)(de)抗體(ti)大部(bu)分(fen)(fen)是識別(bie)線性結構的(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)質。

b. 純化的(de)重(zhong)組蛋白。重(zhong)組蛋白(bai)比(bi)較(jiao)(jiao)容易獲(huo)得(de)，而且(qie)能夠獲(huo)得(de)比(bi)較(jiao)(jiao)高的純度。但是在重(zhong)組蛋白(bai)中我們為(wei)了純化往往要加入一段標簽（比(bi)如(ru)GST， His, Flag等），拿這些帶有標簽(qian)的重組蛋白去免疫動物(wu)，自然也會得(de)到(dao)對標簽(qian)識別的抗體。我們(men)常常用His作為標簽(qian)，因為它比較小，而且免疫原性(xing)比較弱，產生的(de)抗體可(ke)以忽略。制備的(de)抗體可(ke)以識別線性(xing)結構的(de)蛋白質，也(ye)可(ke)以識別天(tian)然折疊狀態下(xia)的(de)蛋白質。

c. 純化的天(tian)然蛋白。天然(ran)蛋白存在(zai)修(xiu)飾，結構(gou)復雜，因此是用來做抗體zui 好的(de)(de)抗原。但(dan)是很(hen)遺憾天然蛋白很(hen)難(nan)達到較高(gao)的(de)(de)純度(du)。制(zhi)備出(chu)來的(de)(de)抗體*是識(shi)(shi)別天然狀態下的(de)(de)蛋白質，對線性結構的(de)(de)也能識(shi)(shi)別。

3. WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC之間對抗(kang)體(ti)(ti)需求有什么(me)區別？

在理(li)解上面技(ji)術對抗體(ti)需求的區別之(zhi)前我們首先(xian)要知道(dao)這些(xie)實驗技(ji)術都需要什么樣(yang)的抗體(ti)。

a. WB. WB的蛋白經過加(jia)熱變性之(zhi)后都(dou)變成線性的結構。因此(ci)zui 好的(de)(de)抗體是采用非常特(te)異(yi)序列的(de)(de)人工合成(cheng)多肽的(de)(de)方法來(lai)做實(shi)驗，結果也非常特(te)異(yi)。

b. IP/CHIP. 我們用(yong)抗體去結合生理(li)狀態下的蛋白質(zhi)，因(yin)此IP的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)最好(hao)使(shi)用純化的(de)(de)天然蛋白(bai)制(zhi)作(zuo)的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)來做，也可以(yi)用純化的(de)(de)重組蛋白(bai)的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)。最好(hao)不(bu)要用人工合成多肽(tai)制(zhi)作(zuo)的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)，因為這種抗(kang)(kang)體識別(bie)的位點(dian)可(ke)能被(bei)深深地藏在了蛋白的內心(xin)深處。CHIP和IP沒有太大的區(qu)別(bie)，wei一(yi)的問題在于，如果抗體識別(bie)的表位和該(gai)蛋白質(zhi)與DNA結合(he)的(de)部位一致，則會(hui)導致CHIP實(shi)驗的(de)失(shi)敗。

c. IF/IHC. 免疫熒光和免疫組化中需(xu)要進行固定一步，固定是為了盡量讓(rang)細(xi)胞的(de)形(xing)態結構維持和原有(you)(you)的(de)一致。這(zhe)種化學物(wu)質的(de)固定使蛋白質變(bian)性凝固，與天然狀態下的(de)蛋白質有(you)(you)了一定的(de)區(qu)別，但(dan)是又不同WB中(zhong)加熱變性(xing)變成了線性(xing)的結構。因此在做IF/IHC實(shi)驗中，最合適(shi)的抗體(ti)可以是純(chun)化(hua)的重組蛋(dan)白得到的抗體(ti)，也可以是人(ren)工合成多肽(tai)得到的抗體(ti)（多肽(tai)是在蛋(dan)白質的表面）

d. FC. 流式(shi)細胞中分(fen)為兩(liang)種，一種是(shi)活(huo)細胞的流式(shi)，這種流失最好(hao)采用是(shi)天然蛋(dan)白(bai)或者重組蛋(dan)白(bai)的抗(kang)體來(lai)做，另外一種是(shi)經過固定(ding)之后的流式(shi)，和IF/IHC 所(suo)用抗體一(yi)致。 在(zai)做流(liu)式(shi)細(xi)胞中，我們有(you)直(zhi)(zhi)接(jie)標(biao)記(ji)(ji)和間(jian)接(jie)標(biao)記(ji)(ji)，間(jian)接(jie)標(biao)記(ji)(ji)不如直(zhi)(zhi)接(jie)標(biao)記(ji)(ji)真實準確(que)。因此(ci)我們選擇(ze)流(liu)式(shi)抗體要采用帶(dai)有(you)熒光標(biao)記(ji)(ji)的抗體；如果研究的蛋(dan)白沒有(you)直(zhi)(zhi)接(jie)標(biao)記(ji)(ji)的抗體，那(nei)么就采用間(jian)接(jie)標(biao)記(ji)(ji)抗體，需要添加熒光二(er)抗。

4. 常見的問題

a. 做流式的(de)(de)抗體和免疫(yi)組化的(de)(de)抗體是(shi)一樣的(de)(de)嗎？

不一定能通用。流式(shi)是用直(zhi)(zhi)接標(biao)記(ji)還(huan)是間接標(biao)記(ji)？如果是直(zhi)(zhi)接標(biao)記(ji)的話，那這個(ge)抗體一般不是FITC標記或者就是TRITC，PE之(zhi)類的(de)(de)。如果(guo)恰好你(ni)的(de)(de)免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)，也是想用熒光素標記(ji)的(de)(de)抗體來直接(jie)標記(ji)，那就可以(yi)通用。如果(guo)你(ni)的(de)(de)免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)要用其它(ta)的(de)(de)標記(ji)的(de)(de)話，或(huo)者(zhe)是間接(jie)標記(ji)的(de)(de)話，就有(you)麻煩(fan)，因為(wei)熒光素的(de)(de)標記(ji)很可能(neng)會影響(xiang)二抗和一抗的(de)(de)結合。

b. 為什(shen)么我的抗體做WB非常好，而做不了(le)IF，IHC等其他(ta)任(ren)何實驗？

首先恭喜你有一(yi)個WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好(hao)(hao)的抗(kang)體(ti)也不容(rong)易(yi)。其次，你(ni)這個抗(kang)體(ti)很可能是通過(guo)人工合成多肽得(de)到(dao)的，和上面所(suo)述，你(ni)用來做(zuo)抗(kang)原的多肽恰好(hao)(hao)被(bei)包埋在蛋白質(zhi)的中心，因此只能識別WB中線(xian)性的部分。

c. 如何選擇(ze)免疫組化抗體？

首先，一(yi)抗是(shi)(shi)選(xuan)擇單(dan)(dan)克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)(ti)還是(shi)(shi)多(duo)克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)(ti)，單(dan)(dan)克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)(ti)特異(yi)性(xing)強，靈敏度低(di)；多(duo)克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)(ti)靈敏度高(gao)，特異(yi)性(xing)弱(ruo)(ruo)。根(gen)據你的實驗結果(guo)，如果(guo)非特異(yi)多(duo)，那么選(xuan)擇單(dan)(dan)克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)(ti)；如果(guo)陽性(xing)信號弱(ruo)(ruo)，不妨(fang)選(xuan)擇多(duo)克(ke)隆(long)抗體(ti)(ti)(ti)試試。一(yi)般家兔來源的都是(shi)(shi)多(duo)克(ke)隆(long)，小鼠來源的是(shi)(shi)單(dan)(dan)克(ke)隆(long)。其次是(shi)(shi)要弄明白該一(yi)抗能夠(gou)識別什么種屬的抗原，抗體(ti)(ti)(ti)說(shuo)明書上(shang)面一(yi)般注(zhu)明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人(ren)Hum。再次比較重(zhong)要的(de)是要注意一抗的(de)來源。比如我們在人的(de)癌組織中做p53的免(mian)疫組化(hua)，一抗(kang)我們(men)采用的是小鼠來源的p53抗體(ti)，那么(me)二(er)抗我(wo)們一(yi)定要選擇 抗小(xiao)(xiao)鼠的(de)二抗比如（山羊抗小(xiao)(xiao)鼠，兔抗小(xiao)(xiao)鼠），這一(yi)(yi)點非常重要。最后，一(yi)(yi)般(ban)的(de)抗體說明書都(dou)會(hui)注明能(neng)做(zuo)(zuo)什(shen)么(me)實驗，如果標明了(le)不(bu)可(ke)(ke)以(yi)做(zuo)(zuo)免疫(yi)組(zu)化(hua)，一(yi)(yi)定不(bu)要選擇(ze)；反過來(lai)說，即使標明了(le)可(ke)(ke)以(yi)做(zuo)(zuo)免疫(yi)組(zu)化(hua)，也(ye)不(bu)一(yi)(yi)定能(neng)夠做(zuo)(zuo)，商家只會(hui)夸大其效果。

d. WB和IF的二抗是一(yi)樣的嗎(ma)？

很(hen)明顯，不是(shi)！免疫熒光抗體是(shi)用于 免疫熒光試驗(yan)的，是用FITC或PE等標(biao)記的抗(kang)體，結(jie)果(guo)需(xu)要(yao)紫外線激發并(bing)用熒光顯微鏡觀察WB抗體(ti)一般是(shi)HRP或堿性磷酸酶等標記(ji)的(de)抗體(ti)，需顯(xian)色底(di)物（如OPD\TMB等）直(zhi)接顯(xian)色（肉眼）或化學發光法(fa)顯(xian)影（需特(te)殊儀器(qi)）。

e. 做CHIP的抗體是(shi)否可以(yi)用來做WB抗體(ti)？

不一(yi)定，一(yi)般來說(shuo)做(zuo)CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方(fang)面都要求(qiu)比(bi)較高，基本上能做CHIP的(de)抗體(ti)都可以做WB。但(dan)是(shi)如果CHIP的抗體(ti)識別的是(shi)(shi)構象表位（比如是(shi)(shi)由(you)兩(liang)(liang)個(ge)實際靠在(zai)一起但變為(wei)線性(xing)結構之后相隔很遠(yuan)的兩(liang)(liang)端序列），而不(bu)是(shi)(shi)線性(xing)表位，這(zhe)種(zhong)CHIP抗體(ti)做(zuo)不了WB。

f. 抗體(ti)說明書上面(mian)沒有寫該(gai)抗體(ti)能夠用于某項實驗(yan)怎么辦？

一般而言，抗體研(yan)發出來之后都要(yao)經過WB，IP，IF，IHC實驗(yan)。檔發現濃度不(bu)夠做IF，IHC時候，國外的(de)(de)抗體一(yi)般(ban)都是(shi)寫(xie)未檢測，國內的(de)(de)抗體一(yi)般(ban)是(shi)不(bu)寫(xie)。所以盡量不(bu)要抱著試試的(de)(de)心里去(qu)嘗試，往(wang)往(wang)只(zhi)會浪費時間。你(ni)想啊，如果抗體能夠(gou)做該實驗，他們肯定會寫(xie)上去(qu)啊。

g. 做ELISA的抗(kang)體(ti)能否用來做WB？

通(tong)常用WB抗體稀釋(shi)濃度(du)為(wei)1:1000，IF/IHC為(wei)1:100，而(er)如果可(ke)以做ELISA則可以稀(xi)釋1:10000。如果一個(ge)抗體用來做ELISA的，那么(me)言外之意就(jiu)是該抗體(ti)效(xiao)價不高(gao)。但不是說ELISA的抗體(ti)不能用于(yu)做WB，抗體說(shuo)明書提(ti)示做ELISA稀釋(shi)比例(li)為(wei)1:1000，那么你(ni)可以(yi)試試1:100做做WB。