什么是熒光定量PCR？

指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個
PCR進程，使每一個循環變得“可見"，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進行定量的方法。

定量PCR原理？

與傳統PCR一樣,反應在溫度模塊里循環進行；理論上每經過一個循環目的基因的數量都會增加一倍；每個循環結束后,定量PCR儀器通過不同的濾光片記錄熒光信號；在擴增過程中,熒光信號隨著PCR產物的增加而增強。

定量PCR體系？

普通的PCR體系；模板,引物,dNTPs，buffer，Taq酶；加入各種類型的熒光染料。

在做Real time PCR時，對于SYBR Green I染料法和Taqman探針法都可以，但是二者有區別。SYBR Green I染料法是利用SYBR Green I結合雙鏈DNA來檢測PCR產物，可用于監測任意雙鏈DNA序列的擴增，但是必須考慮非特異性擴增。因成本相對低，是目前較常用的)。但是由于SYBRGreen I可以與所有的雙鏈DNA結合，包括非特異性的雙鏈DNA序列，因此可能會產生假陽性信號。

圖1：SYBR染(ran)料法(fa)原(yuan)理圖

Taqman探針法使用熒光探針檢測PCR擴增過程中產生的特異PCR產物：特異性熒光信號的產生，需要探針與目標序列進行特異性的雜交；探針可以標記不同的報告基團，因此可以在一個反應管中進行二條序列擴增完整的探針。5′端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3′端熒光淬滅基團(發生熒光共振能量轉移)；退火，探針與模板結合，引物在聚合酶作用下進行延伸反應，遇到探針時發揮3′-5′外切酶活性將探針切碎到反應體系中；報告基團與淬滅基團距離變大，在激發光的作用下發熒光。實驗結果重復性好，價格高。

圖(tu)2：TaqMan探(tan)針法原理圖(tu)

說了這(zhe)么多(duo)，不知道小伙伴(ban)們(men)對qPCR的(de)理解是不是清晰多(duo)了呢(ni)?qPCR作為一種(zhong)簡單(dan)便捷的(de)定量技術，應該(gai)是小伙伴(ban)們(men)常用的技術了。雖然(ran)聽起(qi)來簡單(dan)但(dan)做起(qi)來卻沒(mei)有想象的那(nei)么簡單(dan)，事(shi)實(shi)上，實(shi)驗室做一個(ge)樣(yang)本檢測QPCR需要(yao)1~2個(ge)小(xiao)(xiao)時(shi)，這個(ge)時(shi)候不僅(jin)試劑盒(he)重要(yao)，檢測能力也很重要(yao)，希望(wang)這篇文(wen)章能幫助小(xiao)(xiao)伙伴們對(dui)QPCR有一個(ge)清晰的了解