原代細胞培(pei)養的應(ying)用

1、為(wei)研究生(sheng)物體(ti)細胞的生(sheng)長、代謝(xie)、繁(fan)殖提供有力的手(shou)段;

2、為傳代培養創(chuang)造(zao)條件;

3、服務(wu)于臨床(chuang)實(shi)踐，用于藥物篩(shai)選(xuan)等。

原(yuan)代細胞培養之取材

取材(cai)作為(wei)原代細(xi)胞培(pei)養過程(cheng)中的第一部至關(guan)重要(yao)，以下(xia)幾種(zhong)取材(cai)技術，你都用過哪些方法(fa)呢？

各類組織取材，操作及注意(yi)事項：

1.皮膚(fu)和(he)粘膜

主要(yao)取(qu)皮片，面積一(yi)般2~4平(ping)方厘米。

2.內臟和(he)實體瘤

（1）無菌環境；

（2）熟悉(xi)所需組(zu)織的類型和部位；

（3）要(yao)避開(kai)破潰、壞死液化部分，以防污(wu)染，盡量去除混雜的結(jie)締(di)組(zu)織(zhi)。

3.血液細(xi)胞

一般多抽(chou)取靜(jing)脈(mo)外周血，或從(cong)淋(lin)巴(ba)組織中(zhong)(如脾、扁桃體(ti)、胸腺、淋(lin)巴(ba)結等(deng))分(fen)離細(xi)胞，取材時(shi)應注意抗凝(ning)。

4.骨髓、羊水、胸/腹(fu)水細(xi)胞

嚴(yan)格無菌，注意抗凝，還(huan)要(yao)盡(jin)快分離(li)培養(yang)(yang)，離(li)心后(hou)，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yang)(yang)液洗一次后(hou)即可培養(yang)(yang)，不宜低溫(wen)存放(fang)。

5.動物(wu)組織取材——鼠胚(pei)組織

（1）用引頸或氣管(guan)窒息(xi)致(zhi)死(si)法處死(si)孕期合適的動物；

（2）將其浸泡在含有75%酒精的(de)燒杯中，5分鐘后(hou)取出動物；

（3）在消毒過的木板上(shang)可用無菌的圖釘或大頭(tou)針固定四肢，切開皮膚；

（4）用無菌操作法解剖取(qu)胚(pei)。

6.動(dong)物組(zu)織取材——幼鼠(shu)胚腎(或(huo)肺)

幼鼠采用上(shang)述(shu)方法處死(si)消(xiao)毒(du)后(hou)→腹部朝上(shang)固定在木板(ban)上(shang)，先(xian)切開(kai)(kai)游離(li)毛皮并拉開(kai)(kai)至兩側→采用無菌法打開(kai)胸腔(qiang)取(qu)(qu)肺，或(huo)從背部打開腹腔(qiang)取(qu)(qu)腎。

7.雞(鴨)鳥類胚胎組織

（1）取孵(fu)化至(zhi)適當胚(pei)齡(ling)(9~12天)的胚(pei)蛋(dan)，用照蛋(dan)燈在暗處(chu)燈檢(jian)，若(ruo)有豐(feng)富血管、胚(pei)體(ti)有運(yun)動的胚(pei)蛋(dan)，說明胚(pei)體(ti)發育良(liang)好(hao)，并用有色筆劃(hua)出氣室(shi)和胚(pei)體(ti)位置(zhi)；

（2）將胚蛋置于(yu)蛋架上，先(xian)用溫水清洗蛋殼，再(zai)用75%酒(jiu)精(jing)棉(mian)球擦干;經碘酒(jiu)、75%酒(jiu)精(jing)消毒后，在無菌(jun)條件(jian)下(xia)采用無菌(jun)法用剪刀或鑷子打開氣(qi)室，沿氣(qi)室邊緣去(qu)除蛋殼;

（3）用眼(yan)科鑷撕去(qu)殼膜，暴(bao)露出雞胚;

（4）用彎頭(tou)鑷(nie)輕挑起胚(pei)頭，取出胚(pei)胎(tai)，放入(ru)無(wu)菌平皿中，解剖取材。

   小鼠(shu)小膠(jiao)質細(xi)胞

大鼠血管平滑(hua)肌細胞

原代細胞培養之分(fen)離注(zhu)意事項

1.組(zu)織塊培(pei)養法

（1）組(zu)織塊接(jie)種(zhong)后的(de)(de)前(qian)3天，在(zai)觀察和(he)移動的(de)(de)過(guo)程中，注意不要引起液體(ti)的(de)(de)振(zhen)蕩。要避(bi)免經常翻動和(he)振(zhen)動，否則組(zu)織塊不易(yi)附著于瓶壁上或附著后也(ye)會脫落飄起。

（2）加(jia)入的(de)培養(yang)液不宜過多，避免浸(jin)泡(pao)的(de)組織塊(kuai)受輕微的(de)波動而脫落下來。

（3）當(dang)細胞(bao)向外遷徙出(chu)來后(hou)要注(zhu)意記錄并去除漂浮(fu)的組(zu)織塊和殘(can)留(liu)的細胞(bao)，它們產(chan)生的有毒物質會(hui)影響原代細胞的生(sheng)長。

（4）為促進(jin)組(zu)織塊盡快(kuai)粘貼在培養瓶皿上，可以(yi)在種植(zhi)前(qian)先(xian)將(jiang)膠原薄層涂在培養瓶底壁上。

2.貼壁型原代細胞

（1)原代培養(yang)的(de)分(fen)離細(xi)(xi)胞在初次(ci)接(jie)觸體外環(huan)境時，它們(men)之(zhi)間會互(hu)相影(ying)響，在這些細(xi)(xi)胞之(zhi)間能(neng)產生(sheng)一(yi)些促生(sheng)長(chang)的(de)活性(xing)物(wu)質，使細(xi)(xi)胞彼此互(hu)相促進存活和生(sheng)長(chang)。如(ru)果(guo)接(jie)種(zhong)的(de)細(xi)(xi)胞密度(du)過低，細(xi)(xi)胞之(zhi)間的(de)促生(sheng)長(chang)作用很小，也很難使細(xi)(xi)胞適應(ying)從體內的(de)組織(zhi)環(huan)境到被分(fen)散后進入(ru)獨立生(sheng)存環(huan)境的(de)變化過程(cheng)。如(ru)果(guo)接(jie)種(zhong)的(de)細(xi)(xi)胞密度(du)過大(da)，會導致營養(yang)物(wu)質供應(ying)不足，代謝廢物(wu)積累較快需要經常換液和傳代。

（2）適當增(zeng)大原(yuan)代培養接種的細胞(bao)密度，給培養的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)提(ti)供更多的(de)(de)類(lei)似于在(zai)體內時(shi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)之間的(de)(de)相(xiang)互作用，會極大提(ti)高原(yuan)代培養的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)體外存活率。待細(xi)(xi)胞(bao)(bao)適應體外環境后進(jin)行傳代培養時(shi)再以(yi)較(jiao)低(di)的(de)(de)密度接(jie)種和培養。

（3）盡快(kuai)使接(jie)種(zhong)(zhong)的細(xi)胞貼壁，是決(jue)定培(pei)養(yang)(yang)能否(fou)成功的關鍵。可(ke)以在接(jie)種(zhong)(zhong)后(hou)先將培(pei)養(yang)(yang)瓶置培(pei)養(yang)(yang)箱內培(pei)養(yang)(yang)3h到5h，待(dai)細(xi)胞貼壁后(hou)，再補足培(pei)養(yang)(yang)液(ye)繼續培(pei)養(yang)(yang)。

3.懸浮型原代細胞

（1）必須保(bao)持細胞的(de)(de)懸浮狀(zhuang)態(tai)。可以通過增加培(pei)養(yang)液的(de)(de)黏度來幫助細胞呈懸浮狀(zhuang)態(tai)，如給培(pei)養(yang)液中加入(ru)低濃(nong)度的(de)(de)透明質酸(suan)復(fu)合物。在有(you)攪(jiao)拌(ban)(ban)裝置的(de)(de)培(pei)養(yang)器皿內加入(ru)培(pei)養(yang)液是，以5ml為限度，否(fou)則攪(jiao)拌(ban)(ban)時會產(chan)生(sheng)氣(qi)泡對細胞造成傷害。使(shi)用(yong)這種方式需注意勿(wu)使(shi)攪(jiao)拌(ban)(ban)速度過快，否(fou)則即可使(shi)培(pei)養(yang)液溢出又(you)容易(yi)造成污(wu)染。如果培(pei)養(yang)液的(de)(de)量(liang)在5ml以下(xia)，可以采用(yong)旋轉瓶培(pei)養(yang)。給懸浮培(pei)養(yang)的(de)(de)細胞換液時要注意不要吸出細胞。

（2）能夠進行(xing)懸浮培養(yang)的(de)細(xi)胞，其生命力一(yi)般(ban)都(dou)比較(jiao)旺(wang)盛，體外分裂(lie)增殖的(de)速度較(jiao)快(kuai)，營養(yang)成分消耗大，換液(ye)時間(jian)隔一般較短(duan)。