Q: 什么是蛋白表達和純(chun)化？

蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)表(biao)達是(shi)一(yi)種生(sheng)物技(ji)術過程，用(yong)(yong)于產生(sheng)特(te)定的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)。它(ta)可(ke)以(yi)在(zai)原核生(sheng)物、真(zhen)核生(sheng)物或(huo)體(ti)外(wai)大腸桿菌表(biao)達系統(tong)中進行(xing)。蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)純化(hua)是(shi)一(yi)系列(lie)旨在(zai)從(cong)細胞或(huo)生(sheng)物體(ti)中分(fen)離(li)出(chu)一(yi)個或(huo)幾(ji)個蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)過程。蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)純化(hua)的(de)經常(chang)用(yong)(yong)方法(fa)是(shi)親和層(ceng)析(xi)，它(ta)通過不同(tong)的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)標簽進行(xing)設計。其他(ta)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)純化(hua)方法(fa)包括離(li)子交換層(ceng)析(xi)、分(fen)子排(pai)阻(zu)層(ceng)析(xi)、拋光(guang)純化(hua)和疏水(shui)相互作用(yong)(yong)層(ceng)析(xi)，可(ke)用(yong)(yong)于處(chu)理高純度的(de)無標簽蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)。

Q: 蛋白質是如(ru)何純(chun)化的？純(chun)度(du)是否(fou)有保證(zheng)？

根據融合(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)標(biao)簽(qian)類型和蛋(dan)(dan)白(bai)質本身的(de)(de)(de)(de)理(li)化(hua)(hua)特性(xing)設計最佳(jia)純(chun)(chun)化(hua)(hua)方案。常(chang)用的(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)化(hua)(hua)方法包括：親和層(ceng)(ceng)析、疏水層(ceng)(ceng)析、離(li)子(zi)(zi)交換層(ceng)(ceng)析、分子(zi)(zi)篩(shai)、鹽析等。我(wo)們保證的(de)(de)(de)(de)特別低純(chun)(chun)度標(biao)準(zhun)為(wei)>85%。如果初始純(chun)(chun)化(hua)(hua)未達到此標(biao)準(zhun)或客戶(hu)有(you)(you)更高(gao)的(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)度要求，我(wo)們還(huan)擁有(you)(you)AKATA純(chun)(chun)化(hua)(hua)儀(yi)器，該(gai)儀(yi)器高(gao)度自(zi)動化(hua)(hua)、精(jing)確控制，結合(he)(he)使用各種柱子(zi)(zi)，確保我(wo)們的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質產(chan)品的(de)(de)(de)(de)純(chun)(chun)度進一步提高(gao)，并在COA報告上(shang)顯示(shi)最終純(chun)(chun)度測試結果。

雖然我(wo)們保證的特別低純度標準為(wei)>85%，但我(wo)們制備的一些蛋白質的純度達到了(le)95%甚至(zhi)97%。

Q: 為什(shen)么沒(mei)有或蛋白表達(da)量很低？

可能存在的原因有：

a. 向量(liang)構建錯(cuo)誤。您應該通(tong)過測序確認向量(liang)或申請CUSABIO定制克隆服務。

b. 稀有密(mi)碼子。你應該優(you)化密(mi)碼子，使(shi)用補(bu)充稀有密(mi)碼子的菌株，在較(jiao)(jiao)低(di)的溫度下誘(you)導或在較(jiao)(jiao)差的培養(yang)基中生長

c. 蛋白(bai)質毒性。您應該使用(yong)調控更(geng)嚴格的(de)(de)啟(qi)動子或較低的(de)(de)質粒拷貝(bei)數。在(zai)基于T7系統(tong)的(de)(de)菌株中(zhong)使用(yong)pLysS/pLysE菌株，或者選擇更(geng)適(shi)合表達毒性蛋白(bai)質的(de)(de)菌株。在(zai)高(gao)OD值下開始誘導并(bing)縮(suo)短誘導時(shi)間(jian)。在(zai)使用(yong)含(han)有Lac啟(qi)動子的(de)(de)表達載體時(shi)添(tian)加葡(pu)萄糖。

Q: 如何表達具有生(sheng)物活性(xing)(xing)的蛋(dan)白(bai)質(zhi)？為什么蛋(dan)白(bai)質(zhi)無活性(xing)(xing)？

為了獲得具有生物(wu)活性的蛋(dan)白質，您應(ying)選擇正確的表達系統、適當地表達載(zai)體、合適的純化方法以及驗(yan)證(zheng)實(shi)驗(yan)。此外，您還(huan)可以檢(jian)查以下問(wen)題：

a. 蛋白質(zhi)的(de)溶解度(du)較低(di)(di)。您可(ke)以將所需的(de)蛋白質(zhi)與融合(he)伴侶融合(he)，并降低(di)(di)溫度(du)。

b. 缺乏必要(yao)的翻譯后修(xiu)飾。您應選(xuan)擇(ze)另一個表達系(xi)統。

c. 折疊(die)不完整。您應使用融合伴(ban)(ban)侶(lv)(lv)，并(bing)使用具有冷適應分子(zi)伴(ban)(ban)侶(lv)(lv)的菌株。在較低(di)溫度下與分子(zi)伴(ban)(ban)侶(lv)(lv)共同表達。監測二硫鍵的形成，并(bing)允許(xu)進一步的體外折疊(die)。

d. cDNA中的突變(bian)。您應在誘導前后測序質(zhi)粒，或使用recA－菌株確保質(zhi)粒的穩定性。在每(mei)次(ci)表(biao)達循環前轉(zhuan)化(hua)大腸桿菌。

Q: 如何避免包涵(han)體(ti)的形成并改善可(ke)溶性(xing)表達？

a. 高(gao)親水性或(huo)(huo)跨(kua)膜(mo)結(jie)構的(de)蛋(dan)白質(zhi)。您應該添加(jia)融(rong)合(he)標簽或(huo)(huo)加(jia)入(ru)熱休(xiu)克分子伴(ban)侶。在(zai)低(di)溫下較短時(shi)間誘導表達，或(huo)(huo)者轉換至貧(pin)負載培(pei)養基。產(chan)生截短形式的(de)蛋(dan)白質(zhi)或(huo)(huo)使(shi)用富含膜(mo)的(de)菌株(zhu)。

b. 錯誤的二硫(liu)鍵形成。您應該添加融合伴(ban)侶(lv)蛋白，包括(kuo)巰(qiu)基還原酶(mei)、DsbA和(he)(he)DsbC。克隆到含有分(fen)泌信號肽(tai)的質(zhi)粒(li)中，使(shi)其(qi)分(fen)泌到細胞外腔。使(shi)用具有氧化型胞質(zhi)環境的gamiB (DE3）菌(jun)株。降低誘(you)導劑濃度(du)和(he)(he)誘(you)導溫度(du)。

c. 錯誤的折疊。您應(ying)該使用(yong)融(rong)合伴(ban)侶蛋白(bai)。與分子伴(ban)侶一同共(gong)表達。使用(yong)具有冷適應(ying)分子伴(ban)侶的菌(jun)株。向培養(yang)基(ji)(ji)中添加化學分子伴(ban)侶和輔因子。降低(di)誘導劑濃(nong)度并(bing)添加新(xin)鮮培養(yang)基(ji)(ji)。在(zai)低(di)溫(wen)下較(jiao)短時間誘導表達。

Q: 為什么蛋白(bai)質的分子(zi)量小(xiao)于預測值？

可能存在的原因有：

a. 蛋(dan)(dan)白質序列中包(bao)含罕見的氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)硒蛋(dan)(dan)白質（Sec）或吡咯賴氨(an)(an)酸(suan)(suan)（Pyl）。您應該(gai)使用其他氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)來代(dai)替(ti)這兩種不常(chang)見的氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)。

b. 融(rong)合蛋白(bai)質的翻譯(yi)過程不平衡。您(nin)應該更(geng)換其他的融(rong)合標簽或將融(rong)合標簽移到C端。在低溫下較短時(shi)間誘導(dao)表達，或者轉換至貧負載培養基。

c. 蛋白質降(jiang)解(jie)。您應該(gai)替換特定的蛋白酶位點。使(shi)(shi)用蛋白酶缺陷菌株。在高光密度下誘(you)導(dao)表(biao)(biao)達(da)。在低溫下較短時(shi)間誘(you)導(dao)表(biao)(biao)達(da)，或者在破碎(sui)細胞時(shi)使(shi)(shi)用蛋白酶抑制劑。

Q: 為什么實際的(de)帶狀大小與預測值不(bu)同(tong)？

可能存在的原因有：

a. 翻譯后(hou)修飾。如磷酸化(hua)、糖基化(hua)等會(hui)增加蛋白質(zhi)的大小(xiao)。

b. 翻譯后剪切。許(xu)多蛋白質(zhi)首先合成為(wei)前蛋白質(zhi)，然后通(tong)過剪切產生(sheng)活性形式。

c. 剪接變(bian)體。剪接變(bian)異(yi)可能(neng)從同(tong)一基因(yin)產(chan)生不同(tong)大小的蛋白質。

d. 相(xiang)對(dui)電(dian)荷。氨基酸的(de)(de)組成具(ju)有(you)不同(tong)的(de)(de)相(xiang)對(dui)電(dian)荷，這會影響電(dian)泳遷(qian)移(yi)性(xing)。

e. 多聚(ju)體，例如蛋白質的(de)二聚(ju)化。通常在還原條件下會(hui)被阻止(zhi)，盡管強烈(lie)的(de)相(xiang)互(hu)作(zuo)用可能會(hui)導(dao)致(zhi)出現較高的(de)帶狀。

f. 蛋(dan)白質(zhi)結構，如(ru)二(er)硫(liu)鍵、蛋(dan)白質(zhi)二(er)級結構或(huo)蛋(dan)白質(zhi)三(san)維結構形成。

g. 疏水性蛋白質，如跨膜蛋白質，可(ke)能難以遷(qian)移到(dao)凝膠中，從而導致不同(tong)的多帶(dai)圖案。

Q: 如何重(zhong)溶和儲存產品？

在打開蓋(gai)子(zi)之前，請先離心(xin)試劑(ji)管。

對于短期儲存或使用，請(qing)使用無菌去(qu)離子水(shui)將蛋白質(zhi)全(quan)部(bu)重溶至(zhi)0.1-1.0 mg/mL。如有需要，重溶后經過10—15分鐘后進行分裝，并儲存在(zai)4℃。

對(dui)于(yu)長期儲(chu)存，建議將(jiang)細胞(bao)因(yin)子(zi)或重(zhong)組蛋白添加5%-50%的甘油（最終濃(nong)度(du)），并(bing)進行(xing)分裝以(yi)長期儲(chu)存在-20℃/-80℃。我們默認(ren)的甘油最終濃(nong)度(du)為50%。客戶可以(yi)參考此(ci)濃(nong)度(du)。

Q: CUSABIO使(shi)用哪些(xie)類型的標簽進行融(rong)合？

CUSABIO提(ti)供的常見標簽(qian)(qian)(qian)包括His-tag、FLAG-tag、GST-tag、MBP-tag、組(zu)合標簽(qian)(qian)(qian)（His-GST-tag、His-sumo-tag、His-MBP-tag）等。有(you)時，在制造(zao)過程中會確定蛋白(bai)質的標簽(qian)(qian)(qian)類型(xing)。如(ru)果您有(you)自己定的標簽(qian)(qian)(qian)類型(xing)，請隨時與我們咨詢。

Q: 給定(ding)的(de)標簽類型會對蛋白(bai)質的(de)生物活性(xing)產生什么影(ying)響？

從理(li)論(lun)(lun)上講，小的(de)標簽對蛋白質(zhi)活(huo)性(xing)影(ying)響很小。然(ran)而，具體對蛋白質(zhi)活(huo)性(xing)的(de)影(ying)響無法一概而論(lun)(lun)（有(you)(you)(you)些(xie)蛋白質(zhi)沒有(you)(you)(you)影(ying)響，有(you)(you)(you)些(xie)蛋白質(zhi)有(you)(you)(you)輕微影(ying)響，而有(you)(you)(you)些(xie)蛋白質(zhi)可能(neng)有(you)(you)(you)較大影(ying)響）。

Q: CUSABIO能去除內毒素嗎？

并非所有的(de)內(nei)毒(du)(du)素(su)都可以去除。如果您需要去除內(nei)毒(du)(du)素(su)，請提前與(yu)我們(men)溝通(tong)，該過程(cheng)需要2～3個工作日。我們(men)可以提供免費(fei)的(de)內(nei)毒(du)(du)素(su)去除服務，使(shi)用PMB親和(he)層析(xi)法，并使(shi)用LAL試劑進行(xing)半定量檢(jian)測，確保(bao)內(nei)毒(du)(du)素(su)水平在(zai)0.1 ng/μg（1 EU/μg）以內(nei)。

Q: CUSABIO能提供無(wu)菌生產(chan)加工嗎？

是的(de)，我們(men)可以(yi)提供(gong)這項服務，而且是免費的(de)，但(dan)您需(xu)要(yao)在(zai)下訂單時(shi)備(bei)注此信息。我們(men)在(zai)凍干(gan)之(zhi)前對液體蛋(dan)白進(jin)行了無(wu)(wu)菌處理，但(dan)在(zai)凍干(gan)過(guo)程中可能存在(zai)污染，因(yin)此無(wu)(wu)法保證整個過(guo)程是無(wu)(wu)菌的(de)。

Q: 如何確定細胞因子的(de)物(wu)種交叉反(fan)應性？

a. 除了少數例(li)外(wai)情況(kuang)外(wai)，大多數人類細胞因子在小(xiao)鼠細胞上具有活性。

b. 許多小鼠細(xi)胞因子(zi)也(ye)可能對(dui)人(ren)類細(xi)胞產生影(ying)響，但其(qi)活性可能低于相應的人(ren)類細(xi)胞因子(zi)。

c. 少數人類(lei)細(xi)胞(bao)因子(zi)在(zai)作用于小鼠(shu)細(xi)胞(bao)時會比(bi)相應的小鼠(shu)細(xi)胞(bao)因子(zi)更活躍，例(li)如IL-7。

d. 干擾素、GM-CSF、IL-3和IL-4等(deng)細(xi)胞因(yin)子是物種特異性的，幾(ji)乎對(dui)非同源細(xi)胞沒有活性。

e. 相比之下，成纖維細胞生長因子（FGF）和神經營養(yang)因子在不(bu)同物(wu)種的(de)細胞上(shang)都(dou)具(ju)有良好的(de)活性(xing)，它(ta)們高度保守。

Q: 通(tong)常使用(yong)的防腐劑是什么？通(tong)常添加哪種防腐劑？

常(chang)用(yong)的防腐(fu)劑(ji)包括Proclin 300、偶氮甲烷等。我們的蛋白質產品(pin)中不(bu)添加(jia)任何防腐(fu)劑(ji)。

Q: 蛋白為什么要凍干(gan)？凍干(gan)對蛋白的影響(xiang)有(you)哪些？

蛋白(bai)質對熱敏感，凍干能使絕大部(bu)分蛋白(bai)質的活性保留下(xia)來，提(ti)高蛋白(bai)的穩(wen)定性并延長保存時(shi)間，同時(shi)降低運費。

凍(dong)干(gan)有(you)可(ke)能會造(zao)成蛋白的(de)活性(xing)部分損失，聚集和(he)其它變性(xing)問題。但可(ke)以通過添加(jia)保護劑（穩定劑，添加(jia)劑，輔(fu)料(liao)）和(he)控制凍(dong)干(gan)的(de)各種條(tiao)件來盡可(ke)能降(jiang)低這些(xie)負(fu)面(mian)的(de)影響。

溫馨提(ti)示：武漢華美提(ti)供的蛋(dan)白(bai)(bai)產(chan)品(pin)(pin)一般為凍(dong)干粉，它們(men)(men)在室溫條件下非常(chang)穩定(至(zhi)少(shao)1個月)。盡(jin)管如此(ci)，我(wo)們(men)(men)還是建議您在收(shou)到(dao)我(wo)們(men)(men)的產(chan)品(pin)(pin)后(hou)保存于-20℃ ，以確保蛋(dan)白(bai)(bai)100%的活(huo)性。

Q: 凍干(gan)前為什么向(xiang)蛋白(bai)溶液中加(jia)保護(hu)劑？一般(ban)凍干(gan)保護(hu)劑有哪(na)幾(ji)種？你們的產品(pin)通(tong)常加(jia)的保護(hu)劑是什么？

保(bao)護劑(ji)(ji)是用(yong)來在凍(dong)(dong)(dong)干(gan)和儲存(cun)過程中(zhong)保(bao)護蛋(dan)白(bai)的(de)。常用(yong)的(de)保(bao)護劑(ji)(ji)或穩(wen)定劑(ji)(ji)有糖(tang)類，多元醇(chun)，聚(ju)合物，表面活(huo)性劑(ji)(ji)，某些蛋(dan)白(bai)和氨基酸(suan)等。我們通常加8%（質量(liang)比體積(ji)）的(de)海(hai)藻糖(tang)和甘(gan)露(lu)(lu)醇(chun)作(zuo)為凍(dong)(dong)(dong)干(gan)保(bao)護劑(ji)(ji)。海(hai)藻糖(tang)可明(ming)顯阻止蛋(dan)白(bai)質二(er)級結(jie)構(gou)改變以及凍(dong)(dong)(dong)干(gan)過程中(zhong)蛋(dan)白(bai)質的(de)伸(shen)展(zhan)和聚(ju)集(ji)；甘(gan)露(lu)(lu)醇(chun)也(ye)是一種普(pu)遍應用(yong)的(de)凍(dong)(dong)(dong)干(gan)保(bao)護劑(ji)(ji)和填(tian)充(chong)劑(ji)(ji)，可以降低某些蛋(dan)白(bai)的(de)凍(dong)(dong)(dong)干(gan)后聚(ju)集(ji)情況。

溫馨提示：對于大多數蛋白(bai)，重懸后(hou)在4℃僅(jin)能短期保(bao)存(約1周)。如(ru)想(xiang)長期保(bao)存，請先配(pei)制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白(bai)，如(ru)0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后(hou)分裝凍存于-20℃或-80℃。一(yi)定要避免反(fan)復凍融，因每次(ci)凍融均會引起蛋白(bai)的(de)部(bu)分失活。

Q: 為什么我的(de)管內(nei)幾乎看(kan)不見蛋白產品？

CUSABIO的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)產品(pin)中不含(han)載(zai)體蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)或其它添(tian)加物(如牛血清(qing)白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(BSA)，人血清(qing)白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(HSA)和蔗(zhe)糖等，并以特(te)別低含(han)鹽(yan)量(liang)的(de)溶液進(jin)行凍(dong)干(gan)時，常(chang)常(chang)不能形成白(bai)(bai)(bai)(bai)色網(wang)架(jia)結構(gou)，而是(shi)微量(liang)的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)在凍(dong)干(gan)過程(cheng)中沉積在管(guan)內，形成很薄或肉眼不可(ke)見的(de)透明蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)層。

溫馨提示：在打開管蓋(gai)前，我(wo)們建議您在小離心機中快速離心20-30秒，使附著在管蓋(gai)或管壁上的蛋(dan)白(bai)(bai)聚集于(yu)管底。我(wo)們的質控步(bu)驟保證每管中所含的蛋(dan)白(bai)(bai)量準確無誤，雖然有(you)時您無法(fa)看到蛋(dan)白(bai)(bai)粉末，但(dan)管中的蛋(dan)白(bai)(bai)含量仍(reng)是非常精(jing)確的。

Q: 應如何確定細胞(bao)因子的(de)種屬交(jiao)叉活性？

1) 除少數例外，大(da)多數人類細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)因子(zi)對(dui)小(xiao)鼠細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)均(jun)有(you)活(huo)性(xing)。2) 許多小(xiao)鼠細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)因子(zi)也可(ke)作用于(yu)人類細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，但(dan)比活(huo)性(xing)可(ke)能低于(yu)對(dui)應(ying)的(de)人類細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)因子(zi)。 3) IL-7等為(wei)數不多的(de)人類細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)因子(zi)作用于(yu)小(xiao)鼠細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)時(shi)比對(dui)應(ying)的(de)小(xiao)鼠細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)因子(zi)活(huo)性(xing)更強。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)因子(zi)種屬特異，對(dui)非同(tong)源(yuan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)幾乎沒(mei)有(you)活(huo)性(xing)。5) 相反，成纖維細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)生(sheng)長因子(zi)(FGFs)和神經營養素(neurotrophins)高度保守(shou)，在不同(tong)動物種屬細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)上(shang)均(jun)具有(you)很好的(de)活(huo)性(xing)。

Q: 應如(ru)何正(zheng)確溶解重組蛋白產品？

第1步：開蓋(gai)(gai)(gai)前(qian)離心試(shi)劑管。凍(dong)干(gan)粉(fen)在(zai)(zai)運(yun)輸過程中(zhong)可能(neng)會(hui)因顛簸而漂散并粘貼于管壁(bi)或管蓋(gai)(gai)(gai)上(shang)，所以在(zai)(zai)打開塑料瓶(ping)蓋(gai)(gai)(gai)前(qian)，需將凍(dong)干(gan)粉(fen)通過離心收集到管底(di)，以便用很小體(ti)積(ji)的液體(ti)即可將凍(dong)干(gan)粉(fen)全部溶解。一般需要(yao)3000-3500rpm離心5min，效果良好。

第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可(ke)振(zhen)蕩。這個步驟即為溶解步驟，非常重要。

1) 一定(ding)要用(yong)推薦的(de)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)重懸(或(huo)(huo)溶(rong)(rong)(rong)解(jie))凍干粉。蛋白(bai)的(de)溶(rong)(rong)(rong)解(jie)性與很多因(yin)素有關，其中比較重要的(de)是pH值和(he)離子強度(du)。產品說(shuo)明(ming)上所(suo)(suo)標明(ming)的(de)溶(rong)(rong)(rong)解(jie)液(ye)(ye)是能夠將該細胞(bao)因(yin)子或(huo)(huo)重組(zu)蛋白(bai)全(quan)(quan)部溶(rong)(rong)(rong)解(jie)的(de)液(ye)(ye)體。如果您所(suo)(suo)用(yong)的(de)溶(rong)(rong)(rong)解(jie)液(ye)(ye)的(de)pH值和(he)離子強度(du)與說(shuo)明(ming)書中所(suo)(suo)標明(ming)的(de)不(bu)符(fu)，很多時候會造成細胞(bao)因(yin)子或(huo)(huo)重組(zu)蛋白(bai)不(bu)能全(quan)(quan)部溶(rong)(rong)(rong)解(jie)或(huo)(huo)者(zhe)根本無法溶(rong)(rong)(rong)解(jie)，這樣所(suo)(suo)配(pei)得的(de)細胞(bao)因(yin)子或(huo)(huo)重組(zu)蛋白(bai)必然活性不(bu)夠或(huo)(huo)喪(sang)失。

2) 一(yi)(yi)定(ding)要溶解到自(zi)己定(ding)的(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)。蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)在一(yi)(yi)定(ding)的(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)范(fan)(fan)圍(wei)內可(ke)以保持良好的(de)(de)穩(wen)定(ding)性，這(zhe)個范(fan)(fan)圍(wei)就是(shi)說(shuo)明書(shu)上所標明的(de)(de)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)范(fan)(fan)圍(wei)，一(yi)(yi)般為(wei)0.1-1.0 mg/ml。但這(zhe)一(yi)(yi)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)范(fan)(fan)圍(wei)對(dui)于(yu)不(bu)同的(de)(de)重(zhong)組蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)是(shi)不(bu)同的(de)(de)。高于(yu)或低(di)于(yu)該濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)范(fan)(fan)圍(wei)時細(xi)胞因子或蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)會(hui)不(bu)穩(wen)定(ding)，即很容易出現(xian)活(huo)性下降的(de)(de)現(xian)象。其(qi)次，高于(yu)這(zhe)個濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)范(fan)(fan)圍(wei)，可(ke)能會(hui)超(chao)過該蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)最(zui)大溶解濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)，即蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)無法全(quan)部(bu)溶解。再者，高于(yu)或低(di)于(yu)該濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)(du)范(fan)(fan)圍(wei)，蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)可(ke)能會(hui)出現(xian)聚集(ji)(aggregation)，最(zui)終結果還是(shi)部(bu)分蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)未溶解，導致蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)活(huo)性的(de)(de)減弱。

3) 一(yi)定不能振(zhen)(zhen)蕩(dang)(dang)(vortex)。這里所說的(de)(de)振(zhen)(zhen)蕩(dang)(dang)是指(zhi)用(yong)渦(wo)旋(xuan)儀(yi)進行快速振(zhen)(zhen)蕩(dang)(dang)。請用(yong)放至室溫的(de)(de)緩沖(chong)液作為溶劑。加緩沖(chong)液后，蓋(gai)好瓶塞，輕輕用(yong)手翻轉瓶子(zi)(zi)或把(ba)瓶子(zi)(zi)放在(zai)(zai)一(yi)個(ge)緩慢搖(yao)(yao)擺的(de)(de)搖(yao)(yao)床上。這樣(yang)做來保證緩沖(chong)液能夠(gou)接(jie)觸(chu)到(dao)瓶子(zi)(zi)的(de)(de)整個(ge)內壁。 讓瓶子(zi)(zi)在(zai)(zai)室溫放置至少10 - 15分鐘，然后可以進行分裝或使用(yong)。

第3步：該(gai)重懸液在2-8℃最長可保(bao)存1周(zhou)。

用說明書上推薦的(de)溶液將(jiang)細(xi)胞(bao)因子(zi)或重組蛋(dan)白(bai)重懸到(dao)推薦的(de)濃度后(hou)，細(xi)胞(bao)因子(zi)或重組蛋(dan)白(bai)可(ke)放置在(zai)2-8℃，即(ji)(ji)冰箱(xiang)的(de)冷藏室(shi)。在(zai)這(zhe)種條件下(xia)，細(xi)胞(bao)因子(zi)或重組蛋(dan)白(bai)的(de)活(huo)性最長(chang)可(ke)保持1周(zhou)。這(zhe)對(dui)一(yi)個周(zhou)期(qi)(qi)為5-7天(tian)的(de)實驗，如DC(樹突狀細(xi)胞(bao))的(de)誘導成熟是足夠(gou)的(de)。在(zai)此期(qi)(qi)間，只要每次從冰箱(xiang)里吸取一(yi)定量的(de)細(xi)胞(bao)因子(zi)或重組蛋(dan)白(bai)溶液加入到(dao)培養體系(xi)內即(ji)(ji)可(ke)。

其實，說明書上推(tui)薦的(de)濃度對于一般(ban)的(de)實驗來講是比較高(gao)的(de)。所以用戶通常會(hui)將該溶(rong)液進一步稀(xi)(xi)釋(shi)后再(zai)放在4℃保存(cun)，待1周內用完(wan)。如進行稀(xi)(xi)釋(shi)，必須(xu)遵照下(xia)面第4步的(de)方(fang)法，即需用含載體(ti)蛋(dan)白(bai)的(de)溶(rong)液進行稀(xi)(xi)釋(shi)，否則稀(xi)(xi)釋(shi)后的(de)細胞因(yin)(yin)子(zi)或重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)很容易會(hui)粘附在管壁或瓶(ping)壁上，使得(de)溶(rong)液中的(de)細胞因(yin)(yin)子(zi)或重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)的(de)濃度下(xia)降，細胞因(yin)(yin)子(zi)或重組(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)的(de)總活(huo)性則大為減弱。

第4步：如要長期保存，則需用(yong)含載體蛋白(bai)(如0.1% BSA，或(huo)10% FBS，或(huo)5% HSA)的溶液(ye)進一(yi)步稀釋，然(ran)后分(fen)裝凍存于-20℃至-80℃。

如(ru)(ru)果一(yi)個實驗(yan)周期長(chang)于(yu)一(yi)周，或(huo)(huo)配(pei)制的細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子或(huo)(huo)重(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)一(yi)次用不(bu)完，我們就需對細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子或(huo)(huo)重(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)進行長(chang)期保存(cun)。方法是：將已重(zhong)懸(xuan)的細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子或(huo)(huo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)用含載(zai)體蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)，如(ru)(ru)0.1% BSA(牛血清(qing)白(bai)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai))，10% FBS(胎(tai)牛血清(qing))，5% HSA(人血清(qing)白(bai)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai))的溶(rong)液將重(zhong)懸(xuan)液進一(yi)步稀釋，然后分(fen)裝凍存(cun)于(yu)-20℃至-80℃，即常規冰箱的冷凍室或(huo)(huo)超低溫冰箱中。

在分裝(zhuang)凍存(cun)前，一定要用(yong)含載體蛋白(bai)的溶液將重懸液進一步稀(xi)釋。稀(xi)釋后的細胞因子或(huo)重組(zu)蛋白(bai)可(ke)為任意濃度，因大(da)量的載體蛋白(bai)可(ke)以保證(zheng)低(di)濃度細胞因子或(huo)重組(zu)蛋白(bai)仍然維持較高的穩(wen)定性(xing)。

即在(zai)做無(wu)血清培養或動物的(de)體(ti)內實驗時(shi)，細胞(bao)因子中不(bu)能(neng)含有(you)BSA，FBS或HSA等(deng)動物或人的(de)蛋白，要想(xiang)長期保存細胞(bao)因子或重(zhong)(zhong)組蛋白則(ze)可用海藻(zao)糖(Trehalose)作為載體(ti)，用含海藻(zao)糖的(de)溶液來稀釋(shi)已重(zhong)(zhong)懸的(de)細胞(bao)因子或重(zhong)(zhong)組蛋白，然(ran)后分(fen)裝凍存。