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熒光是一種發射現象，其中吸收輻射的波長始終低于發射（熒光）波長（能量較高）。熒光酶測定利用產物底物熒光光譜的差異來測量酶反應（圖 1）。吸收光后，基態 (S ₀ ) 的熒光團被激發到更高能量的單線態水平。_{在皮秒時間尺度內發生的(de)快速熱化使受激(ji)分(fen)子處于第一激(ji)發態 (S 1} )的很低振動能級。在系統發射光子后衰減回到基態之前，這種激發單線態可以保持很短的時間（納秒量級）。由于這種激發到基態躍遷的能量通常比激發過程的能量低，因此發射的波長通常比激發的波長更長。這種波長差異稱為斯托克斯位移。實際上，所有熒光數據都可以通過五個參數之一來描述：激發光譜、發射光譜、量子產率、熒光壽命以及發射的各向異性或偏振。

圖 1： Perrin-Jablonski 圖。S ₀是基態，而S ₁和S ₂是電子激發態。
參考文獻： Eccleston JF，Hutchinson JP，Jameson D M。藥物化學進展，2005，43：19-48。

熒光測(ce)定(ding)廣泛用(yong)(yong)于(yu)確定(ding)酶反應(ying)的(de)動力學機制，也用(yong)(yong)于(yu)配置高通量篩選的(de)動力學測(ce)定(ding)。要使用(yong)(yong)基(ji)于(yu)熒光的(de)測(ce)定(ding)進行(xing)測(ce)量，反應(ying)需要從非(fei)熒光底物形成(cheng)熒光產物，反(fan)之亦然。第一種情況的一個例子是在水解酶測定中使用非熒光試鹵靈丁酯作為底物，其中酯鍵的酶裂解產生高熒光試鹵靈。后者的一個例子是涉及將 NAD(P)H 氧化為非熒光 NAD(P) ⁺的(de)任(ren)何酶反(fan)應。熒(ying)光共振能量轉移 (FRET) 也可(ke)用于酶測定，其(qi)中酶促反(fan)應改變(bian)底物中兩個熒(ying)光團的(de)距(ju)離或方(fang)向(xiang)，從而改變(bian)觀察到(dao)的(de)供體或受體的(de)熒(ying)光強(qiang)度。

熒(ying)光(guang)酶測(ce)定(ding)(ding)通(tong)(tong)常比分光(guang)光(guang)度測(ce)定(ding)(ding)靈(ling)敏(min)得多，但可能會(hui)受到(dao)雜質(zhi)造成(cheng)的(de)干擾以及許多熒(ying)光(guang)化(hua)合物(wu)在光(guang)照下的(de)不穩定(ding)(ding)性。在當(dang)前階段，對通(tong)(tong)常可從(cong)人類患者獲得的(de)組織、細(xi)胞或(huo)液體的(de)小(xiao)樣本進(jin)行診斷酶評估(gu)的(de)數量不斷增加(jia)，這些測(ce)定(ding)(ding)的(de)高靈(ling)敏(min)度特別(bie)有價值。熒(ying)光(guang)測(ce)定(ding)(ding)還(huan)特別(bie)適(shi)合反應混合物(wu)的(de)小(xiao)型化(hua)。通(tong)(tong)過這種方式，可以進(jin)一步大(da)幅提高靈(ling)敏(min)度，從(cong)而(er)減少對酶和熒(ying)光(guang)底物(wu)樣品的(de)需求。隨(sui)著非常昂貴或(huo)稀缺(que)的(de)熒(ying)光(guang)底物(wu)的(de)出現，后者的(de)保護變得重要(yao)。

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