Peprotech的(de)(de)細(xi)胞因子(zi)或(huo)(huo)重(zhong)組(zu)蛋白以(yi)凍(dong)干(gan)(gan)粉的(de)(de)形式提供(gong)，無任何(he)添加劑、賦形劑及蛋白載(zai)體，這使得細(xi)胞因子(zi)或(huo)(huo)重(zhong)組(zu)蛋白非(fei)(fei)常穩定，在(zai)-20℃或(huo)(huo)-80℃可穩定保存數(shu)年，并且使用非(fei)(fei)常安全，對實驗(yan)結果影響較小。凍(dong)干(gan)(gan)粉在(zai)使用前(qian)需(xu)進行溶解，以(yi)溶液的(de)(de)形式加入到培(pei)養(yang)體系或(huo)(huo)注(zhu)入動物(wu)體內。溶解步驟(zou)非(fei)(fei)常關鍵，溶解不(bu)好會導致細(xi)胞因子(zi)或(huo)(huo)重(zhong)組(zu)蛋白的(de)(de)活性降(jiang)低或(huo)(huo)喪(sang)失，這也是許多客戶經常遇到的(de)(de)問題。

那么應(ying)該如何進(jin)行(xing)正(zheng)確的(de)溶解呢？

下面(mian)以(yi)Recombinant Human IL-4（重組(zu)人IL-4，產品編號(hao)：200-04）的說明(ming)書（COA）為例，對細(xi)胞因子(zi)或蛋白的溶(rong)解方法進行詳(xiang)細(xi)的闡述。

拿到重組人IL-4的(de)說明書(shu)后，您(nin)會發現有一(yi)段關(guan)于Reconstitution（重懸(xuan)）的(de)敘述，這段內容含有溶解相關(guan)的(de)所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening

第 1 步：開(kai)蓋(gai)前離心(xin)試劑管

PeproTech 的細胞因(yin)子或(huo)蛋(dan)白凍干(gan)粉裝盛(sheng)在(zai)塑料管(guan)(guan)中(zhong)，為(wei)無(wu)菌(jun)包(bao)裝。凍干(gan)粉在(zai)運(yun)輸過(guo)程中(zhong)可能會因(yin)顛簸而漂散并粘貼于管(guan)(guan)壁(bi)或(huo)管(guan)(guan)蓋上，所(suo)以(yi)在(zai)打開塑料瓶(ping)蓋前，需將凍干(gan)粉通過(guo)離心收集到管(guan)(guan)底，以(yi)便用(yong)很小體積的液體即(ji)可將凍干(gan)粉全部(bu)溶解(jie)。

有(you)很多用(yong)(yong)戶會問一個(ge)問題，即應該(gai)用(yong)(yong)多少轉速(su)、多長時間離心試劑管，才能(neng)達到(dao)良好的收(shou)集效果？

答：有些小型(xing)高速(su)(su)離心(xin)機(ji)（多為進口品牌）的(de)面板上有一個(ge) Spin 鍵，按了此鍵后(hou)，離心(xin)機(ji)會自動快速(su)(su)上升到其(qi)最(zui)(zui)大(da)速(su)(su)度(10000rpm 或 12000rpm)，上升到最(zui)(zui)高點后(hou)速(su)(su)度即(ji)刻下(xia)降，直至停止旋轉，整個(ge)過程大(da)約 30s。這個(ge) Spin 鍵足以很好的(de)將(jiang)細胞因子(zi)或蛋白收集到管底。

但(dan)有些實驗室沒有這(zhe)樣的(de)高(gao)速離(li)心機，只有最(zui)高(gao)轉速為 4000-4500rpm 的(de)離(li)心機。這(zhe)種情(qing)況下，需(xu) 3000-3500rpm 離(li)心 5min，也能達到類(lei)似的(de)效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.

第(di) 2 步：用無菌水重懸(xuan)至(zhi) 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。

這個(ge)步驟即為溶解步驟，非常重要。

1）一(yi)定要(yao)用(yong)推(tui)薦的(de)溶液重懸（或(huo)溶解(jie)）凍干(gan)粉

用于溶(rong)解(jie)細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子(zi)或蛋白的(de)(de)溶(rong)液千差萬別。此例中的(de)(de)重(zhong)組人(ren)(ren) IL-4 需(xu)(xu)(xu)(xu)用水溶(rong)解(jie)，而(er)重(zhong)組人(ren)(ren) IL-2 （產(chan)(chan)(chan)品(pin)(pin)(pin)編號：200-02）則(ze)需(xu)(xu)(xu)(xu)用 100mM Acetic Acid （醋酸(suan)）溶(rong)解(jie)，重(zhong)組人(ren)(ren)TGF-beta1 （產(chan)(chan)(chan)品(pin)(pin)(pin)編號：100-21）需(xu)(xu)(xu)(xu)用 10mMCitric Acid（檸檬酸(suan)），pH3.0 溶(rong)解(jie)，重(zhong)組人(ren)(ren)FGF-basic（產(chan)(chan)(chan)品(pin)(pin)(pin)編號：100-18B）需(xu)(xu)(xu)(xu)用 5mMTris，pH7.6 溶(rong)解(jie)，重(zhong)組人(ren)(ren)FGF-10（產(chan)(chan)(chan)品(pin)(pin)(pin)編號：100-26）需(xu)(xu)(xu)(xu)用5mMSodium Phosphate（磷酸(suan)鈉），pH7.4 溶(rong)解(jie)，重(zhong)組IL-13（產(chan)(chan)(chan)品(pin)(pin)(pin)編號：200-13）需(xu)(xu)(xu)(xu)用 20mMMHCl溶(rong)解(jie)。（注(zhu)：即使同(tong)一重(zhong)組細(xi)胞(bao) 因(yin)(yin)子(zi)或蛋白，不同(tong)批次的(de)(de)溶(rong)解(jie)方法也可能有所不同(tong)，因(yin)(yin)此上面的(de)(de)敘述僅供參考。 具體應(ying)該(gai)如(ru)何(he)溶(rong)解(jie)應(ying)以相應(ying)批次的(de)(de)說明書為(wei)準）。

經常會有客戶問，為什么有多(duo)種(zhong)溶解方法？

答：我(wo)們知道，蛋(dan)白(bai)的溶(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)性(xing)與很多因(yin)(yin)素(su)有關(guan)，其中(zhong)比較重要的是 pH 值和離(li)子(zi)強度。PeproTech 的細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組蛋(dan)白(bai)在出廠前均經嚴格測試，說明(ming)上所(suo)標明(ming)的溶(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)液是能夠將該細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組蛋(dan)白(bai)全部溶(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)的液體。如果您所(suo)用的溶(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)液的pH 值和離(li)子(zi)強度與說明(ming)書中(zhong)所(suo)標明(ming)的不符，很多時候(hou)會(hui)造成細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組蛋(dan)白(bai)不能全部溶(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)或(huo)(huo)(huo)者根本無法溶(rong)(rong)解(jie)(jie)(jie)，這樣所(suo)配(pei)得的細(xi)胞(bao)因(yin)(yin)子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組蛋(dan)白(bai)必然活性(xing)不夠或(huo)(huo)(huo)喪(sang)失。

有不少(shao)用(yong)(yong)戶沒注意說明書上的描述，而是根據習(xi)慣，直接(jie)用(yong)(yong) PBS 或培養(yang)液（1640或 DMEM等(deng))等(deng)溶解細胞因子或蛋(dan)白的凍干粉。這(zhe)樣做可以(yi)嗎？

答：有時(shi)可以，要(yao)看具(ju)體情況。PeproTech 的(de)(de)大多數細胞因(yin)子或蛋白凍干粉的(de)(de)溶(rong)(rong)解(jie)液不是 PBS，此時(shi)千萬(wan)不能(neng)用(yong) PBS 或培(pei)養液直(zhi)接來溶(rong)(rong)解(jie)，具(ju)體原因(yin)在上面已經(jing)敘述過。而有部(bu)分細胞因(yin)子，如(ru)重組(zu)人 KGF(產(chan)品編(bian)號(hao)：100-19)和(he)重組(zu)人FGF-23(產(chan)品編(bian)號(hao)：100-52)等，說明書上的(de)(de)溶(rong)(rong)解(jie)液即(ji)為(wei) 1x PBS，此時(shi)用(yong) PBS溶(rong)(rong)解(jie)全部(bu)沒問題，那么(me)用(yong)培(pei)養液溶(rong)(rong)解(jie)也是可以的(de)(de)，不過最好(hao)還是用(yong)先用(yong) PBS溶(rong)(rong)解(jie)，然后再用(yong)培(pei)養液稀釋。

2）一定(ding)要(yao)溶解到固(gu)定(ding)的濃(nong)度(du)。

蛋(dan)白(bai)在(zai)一(yi)定的(de)濃度(du)范圍(wei)內可(ke)以保持良(liang)好(hao)的(de)穩定性，這個范圍(wei)就是說明(ming)(ming)書(shu)上(shang)所(suo)標明(ming)(ming)的(de)濃度(du)范圍(wei)，該例為 0.1-1.0 mg/ml。這個濃度(du)范圍(wei)對于不同的(de)細胞因(yin)子或重組蛋(dan)白(bai)是不同的(de)。如重組人FGF-6（產品編號：100-30）為 0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B（產品編號：120-15）則一(yi)定要是0.5mg/ml。

高于或(huo)低于該濃度范圍會(hui)有什么(me)問(wen)題呢？

答：首先，細胞因子或(huo)蛋(dan)白(bai)(bai)會不穩定，即(ji)(ji)很容易出現(xian)(xian)(xian)活性下降的現(xian)(xian)(xian)象。其次，高于(yu)這個濃度范(fan)圍，可能會超過該(gai)蛋(dan)白(bai)(bai)的最大溶解(jie)濃度，即(ji)(ji)蛋(dan)白(bai)(bai)無(wu)法全部溶解(jie)。再者，高于(yu)或(huo)低于(yu)該(gai)濃度范(fan)圍，蛋(dan)白(bai)(bai)可能會出現(xian)(xian)(xian)聚集（aggregation），最終結果還是(shi)部分蛋(dan)白(bai)(bai)未(wei)溶解(jie)，導致蛋(dan)白(bai)(bai)活性的減弱(ruo)。

3）一定不能振(zhen)蕩(vortex)。

這里所說的振蕩是指用(yong)渦(wo)旋(xuan)儀進(jin)行快速振蕩。

有用戶會問，若(ruo)想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實現細(xi)胞因子(zi)或重組蛋(dan)白的全部溶解，該(gai)怎么辦(ban)呢？

答：多(duo)數(shu)細胞(bao)(bao)(bao)因子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組(zu)(zu)蛋白(bai)的(de)凍干(gan)粉是非常容易溶(rong)(rong)解的(de)，一般我們用(yong)移液槍的(de)槍頭輕吹幾下(xia)，即(ji)可(ke)使細胞(bao)(bao)(bao)因子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組(zu)(zu)蛋白(bai)全部溶(rong)(rong)解。對(dui)于不易溶(rong)(rong)解的(de)細胞(bao)(bao)(bao)因子(zi)或(huo)(huo)(huo)蛋白(bai)，PeproTech 會(hui)在說(shuo)(shuo)明書中(zhong)進(jin)行(xing)備注（Note）。如(ru)在重組(zu)(zu)人(ren) IL-13（產品編號(hao)：200-13）的(de)說(shuo)(shuo)明書中(zhong)您(nin)會(hui)看到：Slow to dissolve （緩慢溶(rong)(rong)解），在重組(zu)(zu)人(ren) IL-11（產品編號(hao)：200-11）的(de)說(shuo)(shuo)明中(zhong)會(hui)看到：This solution is slow to dissolve.（該溶(rong)(rong)液溶(rong)(rong)解緩慢）。這種情(qing)況下(xia)，您(nin)最好能將(jiang)要(yao)溶(rong)(rong)解的(de)細胞(bao)(bao)(bao)因子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組(zu)(zu)蛋白(bai)放在水平搖(yao)(yao)床（shaker）上(shang)低速搖(yao)(yao)一段時(shi)間，促使細胞(bao)(bao)(bao)因子(zi)或(huo)(huo)(huo)重組(zu)(zu)蛋白(bai)全部溶(rong)(rong)解。有些蛋白(bai)，如(ru)重組(zu)(zu)人(ren) IL-13 Variant （產品編號(hao)：200-13A）雖然難溶(rong)(rong)，但(dan)卻不需用(yong)搖(yao)(yao)床來加速溶(rong)(rong)解。其說(shuo)(shuo)明書上(shang)的(de)備注為(wei)：Allow the reconstituted vial to sit at 4℃ for at > 2 hours before use.（將(jiang)重懸(xuan)液在 4℃靜置2小時(shi)以上(shang)）。

The solution can be stored at 2-8℃ for up to one week.

第(di)3步：該重(zhong)懸液在2-8℃最長可(ke)保存1周。

用(yong)說(shuo)明(ming)書上(shang)推(tui)薦(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)液重(zhong)(zhong)懸細(xi)胞(bao)因(yin)子或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)白(bai)至推(tui)薦(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)度后(hou)，可(ke)置(zhi)于(yu)(yu)2-8℃儲存，在此(ci)條件下(xia)其活(huo)性(xing)最長可(ke)保持(chi)1周。這對(dui)于(yu)(yu)周期為5-7天的(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)驗，如DC（樹突狀細(xi)胞(bao)）的(de)(de)(de)(de)(de)誘導成(cheng)熟是足夠的(de)(de)(de)(de)(de)。在此(ci)期間(jian)，只要(yao)每次從冰箱里吸取一定(ding)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)因(yin)子或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)白(bai)重(zhong)(zhong)懸液加入到(dao)培養(yang)體(ti)系即可(ke)。一般說(shuo)明(ming)書上(shang)推(tui)薦(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)懸濃(nong)度要(yao)高(gao)于(yu)(yu)實(shi)驗時使用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)度，此(ci)時可(ke)能需(xu)要(yao)對(dui)重(zhong)(zhong)懸后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)液進行(xing)稀釋(shi)。如需(xu)進行(xing)稀釋(shi)，必須遵循第4步中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)方法要(yao)求，使用(yong)含載體(ti)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)液進行(xing)稀釋(shi)。否則(ze)稀釋(shi)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)因(yin)子或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)白(bai)很(hen)容易粘(zhan)附(fu)在管壁(bi)或(huo)瓶壁(bi)上(shang)，使得溶(rong)(rong)液中(zhong)細(xi)胞(bao)因(yin)子的(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)度下(xia)降(jiang)，總的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)活(huo)性(xing)大為減(jian)弱(ruo)。

For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein(example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃。

第4步(bu)：如果要(yao)長期保(bao)存，需使用(yong)含載體蛋白（如0.1% BSA，或(huo)10% FBS，或(huo)5% HSA）的溶(rong)液進(jin)一步(bu)稀釋，然后(hou)分裝凍存于-20℃至-80℃。

如果實(shi)驗周期長于一(yi)周，或配制的(de)細胞因子或蛋白一(yi)次用不完，則需(xu)對細胞因子或重組蛋白進行(xing)長期保存。方法：將已重懸的(de)細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA（牛血清(qing)蛋白），10% FBS（胎牛血清(qing)），5% HSA（人血清(qing)白蛋白）的(de)溶液進一(yi)步稀(xi)釋(shi)，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。

經常(chang)有客戶使用COA上推薦的溶(rong)液重懸細胞因子或重組蛋白(bai)凍干(gan)粉后不使用含載(zai)體蛋白(bai)的

溶液進行(xing)稀釋，而是直接分裝凍存于-20℃至-80℃，這樣可以嗎？

答(da)：不可以(yi)的(de)(de)(de)。我們知道(dao)塑料管(guan)壁對多數蛋白(bai)(bai)均具有很好(hao)的(de)(de)(de)吸附(fu)作用，也就(jiu)是(shi)說溶液中(zhong)的(de)(de)(de)蛋白(bai)(bai)很容易粘附(fu)在(zai)管(guan)壁。粘附(fu)后，蛋白(bai)(bai)是(shi)很難與管(guan)壁分離的(de)(de)(de)，例如ELISA的(de)(de)(de)包(bao)被(bei)抗體（Capture antibody）就(jiu)是(shi)通過這種粘附(fu)作用包(bao)被(bei)到酶(mei)標板上的(de)(de)(de)。

載(zai)體(ti)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，如0.1% BSA（牛血(xue)清蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)），10% FBS（胎牛血(xue)清），5% HSA（人血(xue)清白(bai)(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)）的(de)(de)主要作用是預先封閉塑(su)料(liao)管(guan)(guan)壁上的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)結合位點，使細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)不(bu)會(hui)粘附(fu)于(yu)管(guan)(guan)壁。如果(guo)在細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)凍干粉用推(tui)薦的(de)(de)溶液重(zhong)(zhong)懸后(hou)不(bu)用含載(zai)體(ti)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)溶液進一(yi)(yi)步(bu)稀(xi)釋(shi)，而直接分裝(zhuang)凍存，則(ze)溶液中的(de)(de)大(da)部分細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)均(jun)會(hui)粘附(fu)到管(guan)(guan)壁上，導致溶液中實際溶解的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)濃度(du)大(da)為降低，最終表現為細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)活性(xing)下(xia)降。因(yin)(yin)(yin)此，在分裝(zhuang)凍存時，一(yi)(yi)定(ding)要用含載(zai)體(ti)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)溶液將重(zhong)(zhong)懸液進一(yi)(yi)步(bu)稀(xi)釋(shi)。稀(xi)釋(shi)后(hou)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)可為任意濃度(du)，因(yin)(yin)(yin)為大(da)量的(de)(de)載(zai)體(ti)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)可以保證任意濃度(du)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)仍然(ran)維持(chi)較(jiao)高(gao)的(de)(de)穩定(ding)性(xing)。一(yi)(yi)般(ban)情況下(xia)，推(tui)薦的(de)(de)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數(shu)是原重(zhong)(zhong)懸濃度(du)的(de)(de)5-10倍(bei)，稀(xi)釋(shi)后(hou)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)因(yin)(yin)(yin)子(zi)或(huo)重(zhong)(zhong)組(zu)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)濃度(du)不(bu)低于(yu)10 ug/ml。

那(nei)么，含載體蛋白的溶(rong)液是什么溶(rong)液呢？水可以嗎？

答：水是(shi)不可(ke)以的。該(gai)溶(rong)液通常是(shi)指pH接(jie)近中性，有一定(ding)緩(huan)沖(chong)能(neng)力的緩(huan)沖(chong)液，如PBS，培(pei)養液（RPM1640，DMEM等(deng)）等(deng)。

還有一個經常被(bei)問及的問題，即在做無血清培養或(huo)動物(wu)體內實驗時，細(xi)胞因子中不能含有

BSA、FBS或(huo)(huo)HSA等動物或(huo)(huo)人的蛋白(bai)，想要(yao)長期(qi)保存細(xi)胞(bao)因子或(huo)(huo)重組蛋白(bai)應該(gai)怎么(me)辦呢？

答：一(yi)種方(fang)法是訂購Peprotech的小包裝(zhuang)（Size A）細(xi)胞(bao)因子或(huo)重(zhong)組蛋白，每(mei)次使用(yong)一(yi)支，用(yong)后(hou)(hou)即(ji)廢棄。如(ru)覺得(de)此方(fang)法過于浪費，可使用(yong)5%海藻糖（Fucose）作為(wei)載(zai)體，用(yong)含海藻糖的溶液(ye)來稀釋已經重(zhong)懸的細(xi)胞(bao)因子或(huo)重(zhong)組蛋白，然后(hou)(hou)分裝(zhuang)凍存。