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| IHC信號(hao)微弱/無信(xin)號(hao) | |
| 問題 | 解決方案 |
| 抗(kang)體效力 | a. 抗體效價不高。可通過增(zeng)加(jia)抗體使用濃度，延(yan)長抗體孵育時(shi)間進行調整。 b. 所用抗體不(bu)適用于IHC實(shi)驗。建議在非變性WB上測試該抗(kang)體，以確保抗(kang)體識別非(fei)變性抗(kang)原(yuan)，或(huo)是(shi)選用通過(guo)IHC實驗(yan)驗(yan)證的抗體。 c. 一抗(kang)二抗(kang)不匹配。使用針對一抗(kang)物種來源的二抗(kang)，如一抗(kang)宿主(zhu)為rabbit，則須使用anti-rabbit的(de)二抗。 d. 抗體失活。避免將標記熒(ying)光基(ji)團(tuan)的二抗放置于光照(zhao)環境。 |
| 酶底物(wu)失活或呈色時波長(chang)設置錯誤 | a. 顯色溶液失去(qu)作用，可能是由于底(di)物緩沖液中含有(you)酶抑制劑，或底(di)物緩沖液的(de)pH值(zhi)不適當。建(jian)議取一滴二(er)抗標記酶與底物溶液反應(ying), 可確(que)認顯色溶液是否失去活性。 b. 錯(cuo)誤(wu)的(de)激發(fa)波(bo)長。呈色前確保激發(fa)波(bo)長與使用的(de)熒光基團相(xiang)匹配。 |
| 樣品制備問(wen)題 | a. 脫蠟(la)作用不足。建議延長脫蠟(la)時間，使(shi)用新鮮配制的二甲苯。 b. 固定液(ye)（福爾馬林或 PFA) 可能改變(bian)表位。建(jian)議利用(yong)抗原(yuan)修復方(fang)式(shi)使(shi)表位暴露出來或(huo)縮短固定作用(yong)的時間。 c. 固定(ding)作用不(bu)適當。避免延遲固定(ding)或過度固定(ding)，一般建(jian)議至少固定(ding)6小時以上，18~24小時(shi)已(yi)可(ke)滿足大多數實驗應用。 d. 冰(bing)(bing)凍(dong)(dong)切片(pian)(pian)樣品保存期(qi)過長。冰(bing)(bing)凍(dong)(dong)切片(pian)(pian)制備完(wan)成(cheng)后，最好于(yu)1-2個月內(nei)用(yong)完，超過6個(ge)月的(de)話，建(jian)議制備新的(de)玻片。 e. 熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)染色樣品保(bao)(bao)存不當。熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)基團在(zai)光(guang)(guang)(guang)(guang)線下暴露(lu)時間過長，可能會導致信號(hao)減(jian)弱，建議(yi)在(zai)避光(guang)(guang)(guang)(guang)環境(jing)下進行實(shi)驗和保(bao)(bao)存樣品，也可使用防熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)淬滅(mie)的封片(pian)劑封固樣本。 |
| 樣品屬(shu)性 | a. 靶蛋白(bai)含(han)量低。建議設置為陽性対照組(zu)，增加抗體使用(yong)(yong)量或利用(yong)(yong)放大(da)步驟來放大(da)信號(hao)。 b. 靶蛋(dan)白(bai)為核蛋(dan)白(bai)而(er)抗體(ti)不(bu)能穿(chuan)透(tou)細胞核。建議在封(feng)閉溶液(ye)與抗體(ti)稀釋液(ye)中加入滲(shen)透(tou)試(shi)劑，以促(cu)進(jin)抗體(ti)滲(shen)透(tou)到(dao)細胞內。 c. 靶蛋白(bai)為膜蛋白(bai)而(er)表位可(ke)能因為滲透(tou)作用被破壞或(huo)移(yi)除。建議將緩(huan)沖液中的滲透(tou)試劑減少(shao)或(huo)移(yi)除。 d. 較(jiao)厚的組織。如斑馬魚(yu)全胚胎或(huo)染(ran)色建議(yi)做細胞破膜，以(yi)便抗體(ti)順(shun)利進入胞內與相應(ying)抗原結(jie)合。 關(guan)鍵步驟：在每次的實(shi)驗(yan)中，設置陽性(xing)與陰性(xing)對(dui)照(zhao)組，以確認是該次實(shi)驗(yan)的抗體、試劑、組織切片、實(shi)驗(yan)過程(cheng)的問題(ti)，還是靶蛋白(bai)自身表達(da)量低的問題(ti)。 |
| IHC非特(te)異性染色/背景值比(bi)較(jiao)高 | |
| 問題(ti) | 解決方案(an) |
| 固定方式(shi)或組織自身(shen)可能存在自發熒光(guang) | a. 嘗(chang)試用非醛(quan)類替代醛(quan)類。 b. 用(yong)淬(cui)滅(mie)自發熒(ying)光的染(ran)料或(huo)方法處(chu)理組(zu)織樣品：如短波長(chang)的UV照射、蘇丹黑(hei)等。 c. 將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片（OCT或明膠），減少(shao)固定液的影響。 d. 選擇(ze)不會(hui)與自發熒光競爭的熒光染料。福爾馬林(lin)、PFA或戊(wu)二醛等(deng)會產生高背(bei)景的(de)(de)熒光，尤其(qi)在使(shi)用綠(lv)色、藍色和紅色波長光譜范圍時；組織中的(de)(de)紅細胞或膠(jiao)原蛋白等(deng)組分會產生很強的(de)(de)自發熒光，尤其(qi)是使(shi)用綠(lv)色和紅色通(tong)道(dao)的(de)(de)熒光檢測時。 f. 使用福爾(er)馬(ma)林(lin)或PFA固定過久(jiu)。一般建議至少固定6小時以上(shang)，18~24小(xiao)時已可滿足(zu)大多(duo)數實驗應用，注(zhu)意：如固定時間到了無法繼(ji)續后續脫水、包埋程序，一(yi)定要將組織置換到PBS保(bao)存，切(qie)勿(wu)一直泡于固定液中，否則有可(ke)能造成蛋(dan)白交聯無(wu)法(fa)修(xiu)復。 g. 配置新鮮的固定液 |
| 封閉、洗脫或顯色(se)問題 | a. 增加封(feng)閉液濃度、延(yan)長封(feng)閉時間(jian)。 b. 更換(huan)封閉液成分，注(zhu)意: 封閉液成分不可與(yu)一抗(kang)物(wu)種同來(lai)源，最好與(yu)二抗(kang)物(wu)種同源，如(ru)二抗(kang)來(lai)自馬血(xue)清(qing)，使用馬血(xue)清(qing)可得到較(jiao)干凈的背景。 c. 底物(wu)過量：縮短(duan)底物(wu)孵育時間。 d. 信號過度放大(da)(da)：縮短信號放大(da)(da)試劑孵育時間。 e. 洗脫液(ye)不適合：如(ru)果原本是用PBS，可更換使用TBS |
| 抗(kang)體濃度太高或非特(te)異性結合 | a. 降低抗(kang)體濃度，如1：100調整(zheng)為1：1000。 b. 縮短抗(kang)體孵育(yu)時間(jian)，并在4°c 孵育。 c. 增(zeng)加封閉緩(huan)沖液濃度。 d. 做多個目(mu)標蛋白染色時，建議使用預吸附二(er)抗減少與其他物種(zhong)一抗的(de)交互作用。 e. 針對二抗與組織發(fa)生非(fei)特異性結合的情況建議每次實驗都要設置一組不加(jia)一抗，只加(jia)二抗的對照組，才能確(que)認信號(hao)是來自高背景值還是真實信號(hao)。 |
| 內源性酶(mei)（過氧化氫酶(mei)或堿性磷酸酶(mei)） | a. 使(shi)用酶抑(yi)制劑。 - 過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei)：使用(yong)H2O2 (0.3% v/v) - 堿性磷(lin)酸酶：使用 Levamisol (2 mM) |
| 內源性生物素 | 與 Avidin 孵育以封(feng)閉生(sheng)物素 |
| 組織問題 | a. 脫(tuo)蠟不，可能導(dao)致細胞核染色在呈相(xiang)時(shi)模(mo)糊，亦(yi)可能導(dao)致抗體無法辨認抗原或(huo)者高背景值。 b. 抗原修復方(fang)式不適合，建議更換修復溶液成分或(huo)方(fang)法。 c. 一抗與組(zu)織(zhi)物(wu)(wu)種同源。較常發生在使用鼠(shu)源抗體染(ran)鼠(shu)源組(zu)織(zhi)時，除了避開同樣(yang)物(wu)(wu)種來源的一抗和組(zu)織(zhi)之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑(ji)盒 (GTX83396) 迸(beng)行(xing)實驗(yan)。 d. 任何時候都不要讓組織(zhi)干掉。 |
| IHC實(shi)驗結果(guo)形(xing)態不佳 | |
| 問題 | 解決方案(an) |
| 組織切片從載玻片上脫落 | a. 使(shi)用(yong)新鮮配制、適當帶(dai)電或(huo)疏水處理過的載玻片。 b. 石(shi)蠟切(qie)片(pian)貼于(yu)載玻片(pian)后，于(yu)60°C烘烤3-5小時最為合(he)適，烘烤不(bu)足容(rong)易掉(diao)片。 c. 實驗(yan)過程(cheng)中要輕柔沖洗載(zai)玻片(pian)上的組織。 |
| 組織(zhi)切(qie)片撕裂、褶皺或有氣泡 | a. 切(qie)片刀鈍或(huo)是刀刃(ren)上有(you)缺口。建議使用鋒(feng)利(li)刀片重新制備切(qie)片。 b. 刀刃(ren)上有蠟屑(xie)的(de)積留，請隨時將廢屑(xie)殘渣用(yong)毛刷清(qing)除干凈。 c. 刀(dao)(dao)沒夾緊或刀(dao)(dao)的(de)角(jiao)度傾斜(xie)。適(shi)當調節切片(pian)刀(dao)(dao)的(de)角(jiao)度，并確認刀(dao)(dao)片(pian)和蠟塊都有夾緊。 d. 移動刀(dao)座，如果劃痕還是出現在相同位置，應該是組織標本內有污物(wu)或硬(ying)物(wu)的問題。 e. 確認組織無過(guo)度脫水，并(bing)調(diao)節適當(dang)切片速度。 f. 在(zai)分析實驗結果(guo)時，避免損壞切片(pian)區(qu)域。 g. 避免(mian)展片時于(yu)載(zai)玻片上形成的氣泡。 |
| 組織(zhi)形態分(fen)辨率差 | a. 制備較薄的(de)切(qie)片(pian)。一般來說(shuo)，冰凍切(qie)片(pian)的(de)片(pian)子較厚（約(yue)10-30 um），一般設定刀片溫度為(wei)-10~-20度(du)，如設(she)定溫度(du)太低，可(ke)能(neng)會切(qie)不(bu)好；石蠟切(qie)片的片子(zi)較薄（約5-10 um）。 b. 確(que)認已使用(yong)適當厚(hou)度的(de)蓋玻(bo)片，如使用(yong)油(you)鏡一(yi)定要滴油(you)。 c. 建議使用(yong)激(ji)光共聚焦顯微鏡成像，去除非(fei)焦點平面的(de)噪質(zhi)。 |
| 固(gu)定不或造成物理損(sun)傷 | a. 增加固(gu)定時間。如使用(yong)4 % PFA，一般建議至少(shao)固定6小時(shi)以上，18~24小時已可滿足大多數實(shi)驗(yan)應(ying)用，可依據染(ran)色(se)結果增加固定時間與/或加(jia)入后固定的(de)步驟。注：如固定時間到(dao)了無法繼續后續脫(tuo)水、包埋程序，一定要(yao)將組(zu)織置(zhi)換到(dao)PBS保(bao)存，切勿一直泡于(yu)固定(ding)液中。 b. 增加固定液/組(zu)(zu)織比(bi)例，建議固定(ding)液體積至(zhi)少要是組(zu)(zu)織塊的(de)20倍體積。 c. 準備較小的組織塊（約3-4 mm），以(yi)迸行更(geng)q的浸潤固(gu)定。 |
| 抗(kang)原修復過于(yu)強(qiang)烈(lie) | a. 憑(ping)經驗決定保(bao)留組(zu)織型態(tai)的條件，同(tong)時恢復抗原的免(mian)疫反應性。理論上溫度越高，酸堿值越堿，但(dan)可(ke)能(neng)造成較高的背(bei)景值或組(zu)織型態(tai)破(po)壞(huai)，因此(ci)，建議(yi)從92°C, pH 6開始嘗試(shi)，pH 6的(de)抗原修復液(ye)即適用于(yu)大(da)多數抗體。 b. 使用冰(bing)凍(dong)切(qie)片樣本。冰(bing)凍(dong)切(qie)片一般不做抗(kang)原(yuan)(yuan)修復，因(yin)為抗(kang)原(yuan)(yuan)修復方式對冰(bing)凍(dong)切(qie)片可能(neng)太過強烈，也不需(xu)脫蠟、覆水等(deng)步驟，能(neng)夠較完好地(di)保存細胞(bao)膜表(biao)面和細胞(bao)內多種酶活(huo)性(xing)以及抗(kang)原(yuan)(yuan)的(de)免疫活(huo)性(xing)。 |
| 切片(pian)組織細(xi)胞(bao)形成冰晶 | a. 防止組織(zhi)中(zhong)冰晶形成： -速凍(dong)使(shi)組(zu)織溫度驟降, 減(jian)少冰(bing)晶的形成。 -固定后將組織置于20％～30％蔗糖溶液1～3天，利(li)用高滲吸收組織中水分, 減少組織(zhi)含水(shui)量，可(ke)防止或減少冰晶(jing)的形成。 |
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