實驗(yan)原理

細(xi)胞(bao)克隆(long)形成(cheng)實驗是用(yong)來檢測細(xi)胞(bao)增殖能力、侵襲性、對(dui)殺傷(shang)因素敏感性等(deng)項目的重要(yao)技術方法。

當單(dan)個細胞在體(ti)外增殖6代(dai)以上，其后代(dai)所組成(cheng)(cheng)的細胞群(qun)體(ti)，成(cheng)(cheng)為(wei)集落或克(ke)隆(long)。其中細胞克(ke)隆(long)形(xing)成(cheng)(cheng)率即細胞接種存活(huo)率，表示接種細胞后貼(tie)壁的細胞成(cheng)(cheng)活(huo)并形(xing)成(cheng)(cheng)克(ke)隆(long)的數量。

貼(tie)壁后的(de)細(xi)胞(bao)(bao)不一(yi)定每個都(dou)能增殖(zhi)和形(xing)成克隆，而形(xing)成克隆的(de)細(xi)胞(bao)(bao)必(bi)為貼(tie)壁和有增殖(zhi)活(huo)力(li)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)。

克隆形成率反映細胞群體依賴性和(he)增殖能力(li)兩(liang)個(ge)重要(yao)性狀。

克隆形成的目(mu)的

1）通(tong)過對(dui)細(xi)胞(bao)處理后在細(xi)胞(bao)培養板上(shang)的(de)克隆(long)形(xing)成能(neng)力來提示處理后細(xi)胞(bao)的(de)增殖(zhi)能(neng)力。

2）評價(jia)不同殺傷因素(su)(藥物、基因等)對腫瘤細胞增殖能(neng)力(li)或群(qun)體依賴(lai)性的敏感性;

3）評(ping)價細胞在體(ti)(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)性(xing)(xing)，癌細胞不(bu)一定都可(ke)以(yi)在體(ti)(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)，但若體(ti)(ti)外(wai)克隆能(neng)力越強，即表(biao)明(ming)體(ti)(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)性(xing)(xing)越強，算(suan)是(shi)一種(zhong)模擬體(ti)(ti)內(nei)(nei)成瘤(liu)(liu)的體(ti)(ti)外(wai)實驗。

克隆形成(cheng)的分類

克隆(long)形成依(yi)據(ju)采用的培養介質(zhi)的不(bu)同，分(fen)為平(ping)板克隆(long)和軟(ruan)瓊脂克隆(long)兩類。

1. 平板克隆形成（Colony formation）：細胞(bao)(bao)培(pei)(pei)養在(zai)培(pei)(pei)養基中，應用(yong)于(yu)貼壁(bi)的細胞(bao)(bao)。

2. 軟瓊脂克隆形成（soft agar colony formation）：細(xi)胞(bao)(bao)被瓊脂糖掛(gua)起來(lai)，主要應用(yong)于(yu)懸浮的腫瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)和(he)轉化細(xi)胞(bao)(bao)系。

下面我們就具(ju)體看一下這2種(zhong)實驗技術(shu)的具(ju)體操作(zuo)。

01平板克隆實驗過(guo)程

所需(xu)材(cai)料

• 基(ji)礎培養基(ji)（根據細(xi)胞選擇適用種類）

• 胎牛(niu)血清

• 胰蛋白酶(mei)

• PBS

• 青霉素(su)-鏈霉素(su)溶液（100X）

• 多聚甲醛(quan)固定

• 結晶(jing)紫染液

• Giemsa染液

實驗步驟

一、6孔板

1.將處(chu)于對(dui)數(shu)生(sheng)長期的細(xi)胞胰酶消(xiao)化后，全部培(pei)養(yang)基（基礎培(pei)養(yang)基+10%胎牛血清(qing)）重懸(xuan)成細(xi)胞懸(xuan)液，并計數(shu)；

2.細(xi)胞(bao)(bao)接(jie)種：于6孔(kong)板(ban)培養板(ban)中(zhong)各實(shi)驗組接(jie)種400-1,000個細(xi)胞(bao)(bao)/孔(kong)（根(gen)據(ju)細(xi)胞(bao)(bao)生長(chang)情況(kuang)確定，一(yi)般(ban)為700個細(xi)胞(bao)(bao)/孔(kong)）;

3.繼續培養到(dao)14天(tian)或絕(jue)大多數單個克隆中細(xi)胞(bao)數大于(yu)50為(wei)止，中途每隔3天(tian)進(jin)行換液并觀察細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態；

4.克隆完(wan)成后，在顯(xian)微鏡下對細胞進行拍照，然后PBS洗滌(di)1次，每孔加入(ru)1 mL 4%多聚甲醛固(gu)定30-60 min，PBS洗滌(di)1次；

注意事項

1.每隔3天進行(xing)換(huan)液，在換(huan)液時(shi)，緩慢加(jia)入培養基，避免吹起細胞。

2.染色完成(cheng)后，務必(bi)將染液清洗干凈，不(bu)要(yao)在孔中有殘(can)留。

二(er)、平皿

1. 取對數生(sheng)長期(qi)的各組細胞(bao)(bao)，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成(cheng)單個細胞(bao)(bao)，并把(ba)細胞(bao)(bao)懸浮在全部培(pei)養基（基礎培(pei)養基+10%胎牛(niu)血清(qing)）中(zhong)備用。

2. 將(jiang)細(xi)胞懸液作(zuo)梯(ti)度倍(bei)數稀釋(shi)，每(mei)組5個平行樣。每(mei)組細(xi)胞每(mei)皿分(fen)(fen)別接種100個細(xi)胞于含10ml 37℃預溫(wen)培養(yang)液的皿中(zhong)，并輕輕轉(zhuan)動，使細(xi)胞分(fen)(fen)散(san)均勻。

3. 置37℃、5% CO2及飽(bao)和濕度的細胞培養(yang)箱(xiang)中培養(yang)2～3周。

4. 當培(pei)(pei)養(yang)皿中出現肉眼可見的克(ke)隆時，終止培(pei)(pei)養(yang)。棄去上清(qing)液，用PBS小心浸洗(xi)2次。

5. 加純甲醇或1:3醋酸(suan)/甲醇5ml，固定15分(fen)鐘。

6. 去固(gu)定液，加(jia)適量Giemsa應用染(ran)色液染(ran)10～30分鐘

7. 用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8. 將平皿(min)倒置并疊加一張(zhang)帶(dai)網格的(de)透(tou)明膠片(pian)，用肉眼直接計(ji)(ji)(ji)數(shu)克(ke)隆，或在顯(xian)微鏡(jing)（低倍鏡(jing)）計(ji)(ji)(ji)數(shu)大(da)于(yu)10個細胞(bao)的(de)克(ke)隆數(shu)。最后(hou)計(ji)(ji)(ji)算克(ke)隆形成率。

克隆形成率(lv)=（克隆數(shu)/接種(zhong)細胞(bao)數(shu)）×100%

DU145細胞克隆形成的圖片（相機左，顯微鏡(jing)右）

注意事項

平板克(ke)隆形成實(shi)驗方法(fa)簡單，適用于貼壁(bi)生長的細胞。適宜底物(wu)為(wei)玻璃的、塑料瓶(ping)皿。

實驗成功的(de)關鍵是細(xi)胞(bao)懸液的(de)制備和接種(zhong)密(mi)度(du)(du)。細(xi)胞(bao)一(yi)定(ding)要分(fen)散得(de)好(hao)，不(bu)能(neng)有細(xi)胞(bao)團，接種(zhong)密(mi)度(du)(du)不(bu)能(neng)過大。

數據分析

顯微鏡(jing)下觀察陽性克(ke)隆(long)(long)，即每個(ge)克(ke)隆(long)(long)>50個(ge)細胞，相(xiang)機拍照，數克(ke)隆(long)(long)數（大小約(yue)在0.3-1.0 mm）計算(suan)克(ke)隆(long)(long)形成率，并(bing)統計克(ke)隆(long)(long)大小。

例：如研究某個基(ji)因(yin)對細胞(bao)增殖的影(ying)響，敲低前(qian)列腺癌細胞(bao)株PC3的TCTN1基(ji)因(yin)，顯微鏡下拍照(zhao)（Scale bar=250 μm）和(he)相機拍照(zhao)，克(ke)隆的大(da)小(xiao)和(he)數量(liang)均受到抑制。

02軟瓊脂(zhi)克(ke)隆形成(cheng)

軟瓊(qiong)脂(zhi)克隆形成又名(ming)非錨(mao)定依(yi)賴性(xing)生長實驗Anchorage-independent assay，利用軟瓊(qiong)脂(zhi)為培養介質，使細(xi)胞在懸(xuan)浮狀態下生長。

某些惡性腫瘤細胞，不僅在貼壁狀態下能增殖，在懸浮狀態下也能增殖，進而通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，可用于細胞分化的基礎研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。

1. 具體過程(cheng)：如下(xia)圖所示(shi)   

1. .配制1.2% 和(he)0.7%瓊(qiong)脂，高壓滅菌后，維(wei)持在42℃中使其不(bu)會凝固；

2. 將(jiang)1.2% 瓊(qiong)脂與2×培養基(ji)混(hun)合，鋪入(ru)6孔(kong)板作(zuo)為下層膠，每孔(kong)1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

3. 將制備好的單細胞懸液(ye)與0.7%瓊脂充分混(hun)勻(yun)，加(jia)入6孔板作為上層膠，每(mei)孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加(jia)入培養基，每(mei)3天更換(huan)一(yi)次；

4. 根據細胞的生長速度(du)培養2~3周后顯(xian)微(wei)鏡(jing)下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個克隆>50個細(xi)胞(bao)，顯(xian)微(wei)鏡(jing)拍照。若拍整個孔(kong)，每孔(kong)加入200μl氯化硝基四氮唑藍（NBT）染色，37°C過(guo)夜，拍照。

2. 數(shu)據分析：顯(xian)微鏡或相(xiang)機(ji)拍照，計算克隆(long)形(xing)成率(lv)

例：通過軟瓊脂克隆形(xing)成實驗(yan)檢測ME2蛋白(bai)對神(shen)經(jing)膠(jiao)質瘤細(xi)胞生長的(de)影響。在神(shen)經(jing)膠(jiao)質瘤細(xi)胞GBM8401中將ME2蛋白(bai)敲低，形(xing)成的(de)克隆數減少。

注意事項

1.上(shang)層軟瓊脂(zhi)使(shi)細(xi)胞分散成單個(ge)，下(xia)層軟瓊脂(zhi)作為(wei)支撐防止細(xi)胞貼附生長。最后(hou)鋪上(shang)一層培(pei)養基(ji)是為(wei)了(le)防止膠(jiao)干(gan)燥(zao)，并給細(xi)胞補充(chong)營養，如果做藥物(wu)處(chu)理，則在培(pei)養基(ji)中加入藥物(wu)。

2.上層膠細胞數(shu)目根據不同的細胞類(lei)型而(er)定。一般(ban)以5000個細胞/孔作為起始(shi)濃度，根據需(xu)要調(diao)整。

3.瓊脂(zhi)放(fang)入水(shui)浴(yu)鍋中(zhong)維持在42℃左右。溫度過(guo)低(di)瓊脂(zhi)凝(ning)固，在做(zuo)基底時瓊脂(zhi)凝(ning)固過(guo)快(kuai)會(hui)導致不均一(yi)，溫度過(guo)高則(ze)會(hui)將細胞燙死。此外，實驗過(guo)程中(zhong)速度要(yao)快(kuai)，防止局部結塊。

結語(yu)

2種細胞克(ke)隆方式，如何選擇？

根據實驗對象和目(mu)的選擇，平(ping)板(ban)克(ke)隆(long)檢測(ce)貼壁腫瘤細胞的增殖能(neng)力和致瘤性，軟瓊脂克(ke)隆(long)形成實驗除了檢測(ce)貼壁細胞，還(huan)能(neng)檢測(ce)懸浮腫瘤細胞和轉化細胞系，具(ju)有平(ping)板(ban)克(ke)隆(long)不可取代的優(you)勢。若只是(shi)簡單評(ping)價(jia)貼壁細胞的增殖能(neng)力和群體依賴性，則(ze)選擇平(ping)板(ban)克(ke)隆(long)即(ji)可。

北(bei)京和(he)一生物科(ke)技有限公司專業(ye)代理antibodiesinc全系列產品(pin)，專營進口生物試劑，科學(xue)儀器，實驗消耗品(pin)，化(hua)工原料(liao)及藥(yao)物中間體等(deng)。公司與諸多國外品(pin)牌(pai)簽下(xia)代理，sigma、santa、RD、Abcam、CST、toxin、streck、Biolegend、ebioscience、saracare、polyplus、Beyotime、Novus、moltox等，能(neng)為廣(guang)大(da)科研用戶提(ti)供數萬種試劑、儀器和實(shi)驗(yan)消(xiao)耗品。

我們公司的優勢:

1：與500多家公司(si)合作，基本(ben)什么品牌都能進口，包括(kuo)血清，抗體，耗材，還有部(bu)分(fen)限(xian)制進口的

2：部(bu)分產品(pin)現貨，物流穩定

3：一手(shou)貨源(yuan)，價格價格優，售后齊全，歡(huan)迎新老客戶咨詢訂購(gou)