?抗污(wu)染抗生素

細胞(bao)培養過程中如何避免細胞(bao)污染？

1 進行細(xi)胞培養時(shi)確(que)保處于無菌環境，并使用恰當的滅菌技術(shu)。

2 細胞培養過程(cheng)中所使用的培養基或添加的培養物均要(yao)確保(bao)無菌(jun)無污染。

3 定期使(shi)用顯微(wei)(wei)鏡(jing)或(huo)檢測(ce)試劑(ji)盒監測(ce)細胞培(pei)養(yang)基(ji)，以確(que)保無微(wei)(wei)生物污染。

4 使(shi)用抗污染(ran)抗生素。在原代(dai)細胞培(pei)養(yang)或克隆過(guo)程中(zhong)微生物污染(ran)是難(nan)以發現的(de)，Invivogen公司為此設計(ji)了具有預(yu)防功(gong)能的防污染試劑。Invivogen公司可提供(gong)的抗污染抗生素有Plasmocin™ prophylactic，Normocin™， Primocin™ 及Fungin™。

如(ru)何鑒別(bie)細胞培養過(guo)程中被哪種微(wei)生物污染？

如果(guo)細胞(bao)培(pei)養過程中(zhong)存在細菌和/或真菌(jun)(jun)污(wu)染，可以(yi)使用光(guang)學顯微鏡(jing)進行鑒(jian)別。因為它們的(de)生長速度很快，可以(yi)使細胞培養基出(chu)現渾濁或菌(jun)(jun)斑，一般48小(xiao)時后即可(ke)用(yong)肉眼檢測。隨后可(ke)使用(yong)檢測試(shi)劑盒對(dui)這(zhe)些微(wei)生物種(zhong)類進行鑒定(ding)。然而(er)，支原(yuan)體(ti)污染不能(neng)(neng)直(zhi)接用(yong)肉眼觀(guan)察，也不能(neng)(neng)通(tong)過光學顯微(wei)鏡進行鑒別，只能(neng)(neng)通(tong)過不一樣(yang)的(de)分析方法（如支原(yuan)體(ti)檢測試(shi)劑盒）進行檢測。因此，在細(xi)胞(bao)培養過程(cheng)中(zhong)支原(yuan)體(ti)污染很容易被忽視。Invivogen提供的(de)PlasmoTest™支原(yuan)體(ti)污染檢(jian)測試劑盒結(jie)果可(ke)靠(kao)，分析準確(que)，尤其是可(ke)以排(pai)除假陽性或不確(que)定的結(jie)果。

針對不同微生物的污染，應如何選擇Invivogen的抗污染抗生(sheng)素(su)？

在凍存細胞之(zhi)前(qian)的(de)細胞培養(yang)過(guo)程中，可以添加抗污染抗生素嗎(ma)？

可(ke)以的，在凍(dong)存細胞(bao)之(zhi)前可(ke)以添加Plasmocin™ prophylactic（預防(fang)支原體污染試劑）或廣(guang)譜抗生素(su)Normocin™。但是，在這之前需(xu)使用光學(xue)顯微鏡鑒定(ding)細(xi)胞是否被細(xi)菌或真菌污染，或使用PlasmoTest™支(zhi)原(yuan)體檢測試劑(ji)盒檢測是(shi)否存(cun)在支(zhi)原(yuan)體污染。

Invivogen是否可(ke)以提供(gong)一種可(ke)以同(tong)時抵抗(kang)細(xi)菌(jun)、真菌(jun)、支原體污(wu)染的抗(kang)生素嗎？

Normocin™和(he)Primocin™這兩(liang)(liang)款(kuan)抗生素是廣譜性的，可同時抵御(yu)細菌(jun)(jun)、真(zhen)菌(jun)(jun)、支(zhi)原體的污染。兩(liang)(liang)者的區別是Primocin™推薦(jian)用于(yu)原(yuan)代細胞培養中預防微生物的污染(ran)，而Normocin™則推薦用(yong)于細(xi)胞系培養。

在細胞培養過(guo)程中可以同時使用Invivogen的抗(kang)(kang)(kang)污染抗(kang)(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素及基因(yin)(yin)篩選抗(kang)(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素嗎(ma)？抗(kang)(kang)(kang)污染抗(kang)(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素會影響基因(yin)(yin)篩選抗(kang)(kang)(kang)生(sheng)(sheng)素的作用效果嗎(ma)？

在(zai)細(xi)胞培養過程中可(ke)同時使(shi)用Invivogen的(de)抗(kang)污染抗(kang)生(sheng)素及基因(yin)篩(shai)選抗(kang)生(sheng)素，抗(kang)污染抗(kang)生(sheng)素的(de)使(shi)用(yong)不會干擾常(chang)用(yong)的(de)基因(yin)篩(shai)選抗(kang)生(sheng)素的(de)作(zuo)用(yong)效果，例如G418, Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B和(he) Zeocin™。

?細菌污(wu)染(ran)

細(xi)胞培養過程中應如何鑒(jian)別細(xi)菌污染(ran)？

由于細菌比真核細胞小很(hen)多(duo)，因此在細菌污染的早期階段通常被認為是細胞碎(sui)片。這個時候應(ying)使用放大倍數為100×-400×的光學顯微鏡(jing)觀(guan)察細(xi)(xi)胞培養基的狀(zhuang)態。如(ru)果觀(guan)察到黑色斑點、桿狀(zhuang)物或螺旋狀(zhuang)物，那培養基應該是被(bei)細(xi)(xi)菌污染了。由于細(xi)(xi)菌生長快速(su)，在污染后的48小時(shi)內便(bian)可引起培(pei)(pei)養(yang)基的(de)變(bian)化，使培(pei)(pei)養(yang)基變(bian)渾濁。若(ruo)培(pei)(pei)養(yang)基中含有(you)酚紅(hong)，由于細菌的(de)新陳(chen)代(dai)謝使培(pei)(pei)養(yang)基的(de)pH下降，從而導致培養基的顏色迅速變為黃色。因此在(zai)細菌污染48小時之后，便(bian)可用(yong)肉眼直接(jie)觀察。微(wei)生(sheng)物污染后的細胞培(pei)養基(ji)應該(gai)棄去(qu)，但如果(guo)沒有其他替(ti)代的培(pei)養基(ji)可用(yong)，則可使用(yong)Invivogen的Plasmocin™ Treatment, Normocure™或者 Plasmocure™污染(ran)物(wu)清除試劑。

當在細(xi)胞培養過程中不確定具體(ti)是哪種細(xi)菌(jun)污(wu)染(ran)細(xi)胞時，應該(gai)選(xuan)擇哪種抗污(wu)染(ran)抗生素？

當不確定(ding)細胞是被哪種細菌(jun)污染時，推薦(jian)使用對(dui)革(ge)蘭氏(shi)陰性菌(jun)和革(ge)蘭氏(shi)陽性菌(jun)均(jun)有效，具有光譜抗(kang)性的Normocure™。目(mu)前的研究結果(guo)表明，Normocure™可有效預防細(xi)胞培(pei)養(yang)過程中的細(xi)菌(jun)(jun)污(wu)染(ran)，例如葡(pu)萄球菌(jun)(jun)、無(wu)色桿菌(jun)(jun)。

?真菌污(wu)染

細胞培養過程中應如(ru)何鑒別真菌污染(ran)？

由于(yu)真菌菌絲可(ke)用(yong)肉眼或光學顯微鏡觀察(cha)，因此真菌污染細胞培養基之后可(ke)直接通(tong)過肉眼或者(zhe)光學顯微鏡進行檢測。酵母（30-10 um）是形態結構最小的真(zhen)菌(jun)，在(zai)光學顯微鏡(jing)下便可被觀察到。另(ling)外，真(zhen)菌(jun)的生(sheng)長(chang)繁殖會導致培養基中pH值增加，從而使(shi)含酚紅的培(pei)養(yang)(yang)基呈粉色。在(zai)大量真菌污(wu)染物存在(zai)的情況下，菌落可能形成(cheng)霉菌，漂浮在(zai)培(pei)養(yang)(yang)基表面(mian)。此時應立即丟棄培(pei)養(yang)(yang)基，以防孢(bao)子傳播(bo)。

細胞(bao)培養過程中為預防(fang)或(huo)清除真菌污染，Fungin™可以(yi)與青霉(mei)素、鏈霉(mei)素（Pen-Strep）同時使用(yong)嗎？

可以的，Fungin™可以與一(yi)(yi)般的抗生素如(ru)青霉素、鏈霉素一(yi)(yi)起使(shi)用。

Fungin™可以(yi)在麥康凱瓊(qiong)脂培(pei)養(yang)基（MacConkey Agar）和血平板培養基中使(shi)用嗎？ 

可以的，Fungin™可以在(zai)其他(ta)培養基，如麥(mai)康凱瓊脂培養基（MacConkey Agar）和(he)血平(ping)板培養基中使用。

已經使用Fungin™處理了(le)7天(tian)，但不確定真菌污染是否已全部被清除，對于這個(ge)問題有什(shen)么(me)建議嗎？

Invivogen建議將培養(yang)基分成(cheng)兩份，一份繼續使(shi)用Fungin™繼續處理3-4天(tian)，另外一(yi)份中加入無Fungin™或青霉素-鏈(lian)霉素的新鮮培養基，之后(hou)取(qu)1 mL至沙氏葡萄糖瓊脂培(pei)養基中，將培(pei)養皿置于20-25℃ 3-5天。此方法可以幫您確認培養基中的(de)真菌(jun)污染物(wu)是(shi)否已全部被清除。

推薦使用什么濃度的Fungin™處理細胞？

說明書中推薦使用50 ug/mL的(de)Fungin™處理細胞(bao)，但Invivogen建議(yi)同時(shi)做(zuo)75 ug/mL的平行處(chu)理組，以(yi)估計去除(chu)真菌污染的最佳(jia)使(shi)用(yong)劑量。處(chu)理時(shi)間應持續5-10天。

?支原體污(wu)染(ran)

如何使用(yong)Invivogen的支原體檢測試劑(ji)盒Plasmo TestTM檢測支原體？

PlasmoTest™支原體(ti)檢測試劑盒是一(yi)種基(ji)于細胞(bao)的比色分析(xi)方法(fa)，利用Toll樣受體(ti)II可以識別支原體(ti)(ti)成分（脂肽(tai)）的能(neng)力，誘導信號級聯反應，導致NF-κB和其他轉(zhuan)錄因(yin)子的激活。在支(zhi)原體存在的情(qing)況下，HEK-Blue™-2細胞表(biao)面表(biao)達的TLR2會激(ji)活這些轉錄因(yin)子，進而誘導分泌sAP（分泌(mi)性(xing)堿(jian)性(xing)磷酸酶）報(bao)告蛋(dan)白，可在16 - 24小時內被HEK-Blue™檢(jian)測培養基檢(jian)測到。

Invivogen的支原(yuan)體檢測試劑盒Plasmo TestTM只能檢測活的(de)支原體嗎(ma)？

PlasmoTest™支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)檢(jian)測(ce)(ce)試劑盒(he)是通(tong)過檢(jian)測(ce)(ce)支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)脂蛋白(bai)來判(pan)斷是否有(you)支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)存在的(de)，因此其既可以(yi)(yi)檢(jian)測(ce)(ce)細胞培養(yang)基(ji)中存在的(de)活的(de)支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)，也可以(yi)(yi)檢(jian)測(ce)(ce)死的(de)支(zhi)原(yuan)(yuan)體(ti)。

另外，Invivogen的PlasmoTest™支原(yuan)體(ti)檢測(ce)試劑盒不僅(jin)可(ke)以檢測(ce)支原(yuan)體(ti)的脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)，也(ye)可(ke)以檢測(ce)細(xi)菌的脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)。但(dan)是由于細(xi)菌污染可(ke)直(zhi)接通過觀察細(xi)胞培養基(ji)的狀態進(jin)行鑒定，因此，當PlasmoTest™檢測試劑盒結果呈現陽性，且細胞培養基無渾濁、顏色無變化時，可以斷定培養基受到了支原體污(wu)染。

Invivogen的(de)支原體(ti)(ti)檢(jian)測試劑盒Plasmo TestTM與(yu)其(qi)他支原體(ti)檢測試劑(ji)盒相比，有什么優(you)勢嗎？

PlasmoTestTM是(shi)第一個基于(yu)細胞分(fen)析原理檢(jian)測細胞培(pei)(pei)養基中支原體污染的(de)試劑盒(he)，操(cao)作(zuo)者(zhe)只(zhi)需具有基本的(de)細胞培(pei)(pei)養的(de)知識(shi)即可進(jin)行操(cao)作(zuo)。試劑盒(he)在過夜孵育之(zhi)后，一小時之(zhi)內即可獲得檢(jian)測結(jie)果。以往常(chang)用(yong)的(de)支原體檢(jian)測方(fang)法是(shi)PCR，但這種檢測(ce)方(fang)法具有明顯的缺陷，例(li)如假陰性結(jie)果(guo)且(qie)能夠檢測(ce)的支原體種類(lei)受引物限制，無法對全部支原體進行檢測(ce)。最重要(yao)的是，Plasmo TestTM檢(jian)測(ce)結果(guo)呈(cheng)陽性時(shi)，即表明細胞(bao)培養基中存(cun)在支原體污染物(wu)，因此不會(hui)出現(xian)假(jia)陽性結果(guo)。

在(zai)細胞培(pei)養(yang)過程中使(shi)用(yong)哪種(zhong)試劑來(lai)預(yu)防支原(yuan)體(ti)污染？使(shi)用(yong)那種(zhong)試劑清(qing)除(chu)已污染的支原(yuan)體(ti)？

● Plasmocin™ prophylactic（支原(yuan)體(ti)預防(fang)試劑）是(shi)專門用于(yu)預防(fang)支原(yuan)體(ti)污染(ran)的(de)，它含有兩(liang)種有效的(de)殺(sha)菌成(cheng)分，作用于(yu)蛋白質合(he)成(cheng)和DNA復制(zhi)。

● Plasmocin™ treatment（支原體清除試劑），可在2 - 3周內快速有效地消除支原體(ti)污染。如果2-3周之后使用Plasmocin™支(zhi)(zhi)原體(ti)清除(chu)(chu)試劑之(zhi)后無法有效清除(chu)(chu)支(zhi)(zhi)原體(ti)污染，或支(zhi)(zhi)原體(ti)對Plasmocin™產生了(le)耐藥性(xing)，可使(shi)用● Plasmocure™。Plasmocin™ treatment和Plasmocure™均是(shi)由(you)兩種不同抗(kang)生(sheng)素混合而成，通過(guo)不同的機制發揮作用(yong)，可(ke)使支(zhi)原體在(zai)2 - 3周內全(quan)部(bu)清(qing)除。

在(zai)細胞(bao)培養時，可以直接(jie)使用Plasmocure™代替Plasmocin™ treatment清(qing)除已污染的支(zhi)原(yuan)體嗎？

Plasmocin™ treatment和(he) Plasmocure™均(jun)是混合抗生素，用于清除(chu)已污(wu)染(ran)支原體(ti)。然而，Invivogen推薦(jian)只有在支(zhi)原(yuan)體對Plasmocin™ treatment產生抗性的情況(kuang)下才可使用Plasmocure™。

如果支原體(ti)(ti)對Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均已產生抗性，應該怎么辦呢(ni)？

如果使用Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均無法(fa)有效清(qing)除細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)支(zhi)原體(ti)(ti)污(wu)染物，則表明樣本(ben)中(zhong)的(de)支(zhi)原體(ti)(ti)污(wu)染非(fei)常(chang)嚴(yan)重。這種情況(kuang)下好的(de)辦(ban)法(fa)是在(zai)下一次傳(chuan)代時(shi)盡(jin)可能稀(xi)釋(shi)您的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，以此來稀(xi)釋(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)支(zhi)原體(ti)(ti)污(wu)染物。之后使用(yong)不(bu)同濃度（確保(bao)對細(xi)(xi)(xi)胞(bao)不(bu)會有太大毒性的(de)濃度）的(de)Plasmocure™再次處理細胞2周(zhou)，例如使用工作濃(nong)度(du)為(wei)50 ug/mL和100 ug/mL的(de)Plasmocure™處理細胞(bao)。處理2周之(zhi)后，將(jiang)細胞分成(cheng)兩份(fen)，一份(fen)使(shi)用(yong)Plasmocure™繼續處理一(yi)周，另一(yi)份不添加任何抗(kang)生素，3天后使用(yong)PlasmoTest™支原體(ti)(ti)(ti)檢測試劑盒(he)檢測污染情況，以避免(mian)出現假陰性結(jie)果(guo)。如果(guo)您的細胞仍(reng)存(cun)在支原體(ti)(ti)(ti)污染，請重復以上步驟。

以上(shang)的操作步驟可(ke)有效清除90%的支原體污染(ran)，若您樣本中的支原體污染(ran)物未得到有效清除(chu)，請及時(shi)聯系我們。