DNA 旋轉酶(mei)是一種不(bu)一樣的拓撲異構酶(mei)，因為它是能夠催化 DNA 負(fu)超螺(luo)旋的酶(mei)。該過程依(yi)賴于(yu) ATP，通(tong)過雙鏈 DNA 的切割和重新連接以 2 步進行。

有關該(gai)反應的概述(shu)，請參(can)閱(yue)：McKie ,  SJ 、  Neuman,  KC和 Maxwell,  A.  ( 2021 )。DNA 拓撲異構酶：通過結構功能分析進一步了解細胞作用和多蛋白復合物。BioEssays  ，  43 ，e2000286。

典(dian)型反應如(ru)下(xia)：

將 1 U DNA 促旋酶與(yu) 0.5 µg 松弛 pBR322 DNA 在(zai)(zai) 30 µl 反應(ying)體系中(zhong)在(zai)(zai) 1X 檢測緩沖液中(zhong)于 37°C 下(xia)孵育 30 分鐘

通過添加 30 µl 氯(lv)仿/異(yi)戊(wu)醇 (24/1) 和 30 µl 終止(zhi)緩沖(chong)液(ye) (STEB：40% 蔗糖、100 mM Tris.HCl (pH 7.5)、100 mM EDTA、0.5 mg/ml 溴(xiu)酚(fen)藍) 來終止(zhi)每(mei)個反應，然后將其加載到瓊脂糖凝膠上(shang)。(0.8%-1.0%：w/v)

凝膠可(ke)以在 TBE（90 mM Tris.Borate、2 mM EDTA）或 TAE（40 mM Tris.Acetate、2 mM EDTA）中(zhong)運行，但如果在 TAE 中(zhong)以最高 90V 運行 2 - 3 小(xiao)時，超螺旋 pBR322 的分(fen)辨(bian)率會好(hao)得多。

典型凝膠：

所(suo)用(yong)的(de) DNA 底(di)物（本例中(zhong)為(wei)松弛(chi)的(de) pBR322）通常由瓊脂糖凝膠上的(de)一(yi)系列條帶(dai)組成。這些條帶(dai)是(shi)拓撲異構(gou)體(ti)（具有不同連接數的(de) DNA）。

用 DNA 促旋酶處(chu)理松(song)弛(chi)的(de) pBR322 可將(jiang)松(song)弛(chi)的(de)拓(tuo)撲異構體轉化為質粒(li)的(de)超(chao)螺旋形式，后者在瓊脂糖凝膠上遷(qian)移(yi)速(su)度更快。還(huan)可以看到(dao)上部條帶，這是開(kai)環(huan)（有缺口）DNA，它存在于松(song)弛(chi)的(de)基(ji)質中，但(dan)與一些松(song)弛(chi)的(de)拓(tuo)撲異構體一起遷(qian)移(yi)。

嵌(qian)入(ru)劑

如(ru)果(guo)凝膠(jiao)槽中存在溴化乙錠(ding)或氯喹等污染物，則檢測可(ke)能(neng)(neng)會(hui)出現(xian)問題。這些(xie)化學物質(zhi)是嵌入劑，會(hui)影響 DNA 的(de)(de)移(yi)(yi)動性(xing)，導致結(jie)果(guo)混亂。如(ru)果(guo)緩沖液中存在嵌入劑，則松弛的(de)(de)拓撲(pu)異構體會(hui)提(ti)高移(yi)(yi)動性(xing)，并大致在與負超(chao)螺(luo)旋質(zhi)粒相同的(de)(de)位置(zhi)運行(xing)。根據嵌入劑的(de)(de)量，負超(chao)螺(luo)旋 DNA 的(de)(de)移(yi)(yi)動性(xing)可(ke)能(neng)(neng)略低于(yu)正常水平。

核酸酶

如果檢(jian)測中存在污染性(xing)核酸酶（由于檢(jian)測緩(huan)沖(chong)液被(bei)污染或細胞表(biao)達的不純級分），切口(kou)可(ke)能會顯著增加，從而導致開環(huan) DNA 的數(shu)量增加，并可(ke)能產生線性(xing) DNA。這在 OC 和 SC 之間以(yi)單(dan)一帶的形式運行。

ATP

之前活(huo)性(xing)(xing)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)(xing)喪失(shi)可(ke)能是由(you)于緩(huan)沖液(ye)中 ATP 的(de)劣(lie)化所致(zhi)，盡(jin)(jin)管(guan) 5X 檢測(ce)緩(huan)沖液(ye)已被開發以(yi)盡(jin)(jin)量減少這種情況。如果發生活(huo)性(xing)(xing)喪失(shi)，則在反(fan)應(ying)中添加額外的(de) ATP 將克服該問題。

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