大多數腫瘤(liu)分析檢測工作流程使用福爾馬林固定和石蠟包(bao)埋 (FFPE) 的組織活檢樣(yang)本，該過(guo)程會給組織標本中的核酸(suan)帶來化(hua)學損傷。從 FFPE 組織中提取(qu)的(de)(de) DNA 中可能會發現脫(tuo)(tuo)嘌呤(ling)、脫(tuo)(tuo)嘧(mi)啶、脫(tuo)(tuo)氨、氧化、缺口和雙鏈斷裂(lie)，從而導致核酸碎片化。胞嘧(mi)啶脫(tuo)(tuo)氨會導致測序結(jie)果(guo)不正確(que)，并(bing)可能影(ying)響(xiang) FFPE DNA 樣本中較低頻率(lv)變異的(de)(de)準確(que)識別(bie)，但所有類型(xing)的(de)(de)損傷都會影(ying)響(xiang)測序質量（例如覆蓋(gai)均勻性）和下游基因組分析。1

為了評估核(he)酸損(sun)傷(shang)和提取方法對(dui)NGS的影響為了評估(gu)結果并驗證分析工作流(liu)程(cheng)對 FFPE 樣本的適用性，應包括(kuo)全流(liu)程(cheng) FFPE 參考材料。但是，它(ta)應該代(dai)表真實樣本才有用。1 LGC Clinical Diagnostics開發了(le)一系列(lie)此類(lei)參考材料，用于分(fen)析 DNA 變體、RNA 融合和復雜(za)的(de)基因組(zu)特征（TMB、MSI 和 HRD），包括(kuo)模擬存檔組(zu)織活檢標(biao)本損(sun)(sun)傷和尺寸(cun)分(fen)布的(de)受(shou)損(sun)(sun) FFPE DNA 產品。

從(cong) FFPE 樣(yang)本中獲得的(de)(de) DNA 產量、完整性、測序指標(biao)和(he)測量的(de)(de)變異等位基因頻率 (VAF) 可能因使用的(de)(de)提(ti)取(qu)試劑盒(he)而有很大差異。2這種差異可能是由于不同片段長度(du)的 DNA 的相對提取效率不同，以及在使用相應試劑盒進(jin)行 DNA 分離過程中逆(ni)轉甲醛(quan)損傷的偏差。

雖然 Seraseq ® FFPE 參(can)考材料保證每卷 DNA 產(chan)(chan)量(liang) >100 ng 或 RNA >400 ng，但這僅(jin)適用于使用與 LGC Clinical Diagnostics 用于產(chan)(chan)品發布(bu)測(ce)試的(de)相同提取(qu)試劑盒的(de)情況(kuang)，因為產(chan)(chan)量(liang)可能會有所不同（見(jian)表 1）。雖然較低(di)的(de)產(chan)(chan)量(liang)不會影響下游結果，但最大限(xian)度(du)地提高核酸(suan)提取(qu)的(de)性(xing)能可確保將足夠的(de)樣本輸(shu)入到不同的(de)測(ce)序方案中。以下是一些有助于防止產(chan)(chan)量(liang)低(di)和(he)樣本損失的(de)建議，重(zhong)點是 DNA 提取(qu)。

表 1.不(bu)同 Seraseq ® FFPE 參考材料獲得(de)的 DNA 和(he) RNA 產(chan)量的差異。對于所有(you)值，± 表(biao)示(shi)一(yi)個(ge)標準差；除非另有(you)說(shuo)明，否則數據代表(biao)單個(ge)批次(ci)的材料。#所有發布批次(ci)的平均(jun)內部數(shu)據(ju) * 來(lai)自外部實驗室的數(shu)據(ju)。

從生物合成(cheng) FFPE 樣本中提取 DNA 的成功步驟  

Seraseq ®樣(yang)本(ben)顆(ke)粒比臨床(chuang)樣(yang)本(ben)的顆(ke)粒更(geng)小(xiao)、更(geng)透(tou)明(ming)，可能難以看到(dao)。采取以下預防措施可能會有(you)所幫(bang)助(zhu)：

• 將(jiang) Seraseq ®樣本與臨床樣本一起提取，以便直觀地(di)追蹤(zong)樣本。

• 在管子和蓋子的(de)外側(ce)做上標記，然后將其放入離心(xin)機中，使(shi)標記朝(chao)向轉(zhuan)子的(de)外側(ce)（預(yu)計(ji)有沉淀物的(de)位置）。

• 當(dang)使用需要丟棄上(shang)清(qing)液的協議時，如(ru)果對沉淀(dian)的位置有任何疑問，請(qing)在(zai)前幾次運行中保存(cun)上(shang)清(qing)液。

使用自動化(hua)方(fang)案提取的 DNA 產(chan)量往往低于相(xiang)應的手(shou)動方(fang)案。使用自動化(hua)提取系統時(shi)，我們(men)始終建議使用(yong)參考材料(liao)（例如 Seraseq ® WT FFPE 材(cai)料）驗證新的自動化(hua)儀器(qi)。

QIAamp®DNA FFPE 組織試(shi)劑盒 (Qiagen)

• 可(ke)以將(jiang)(jiang) 1 mL 二(er)甲苯直接加入裝有(you)(you)卷(juan)(juan)曲的產(chan)品管(guan)小(xiao)瓶(ping)中(zhong)（圖(tu) 3A），以避免(mian)卷(juan)(juan)曲轉(zhuan)(zhuan)移(yi)。撕(si)掉產(chan)品管(guan)標簽可(ke)能(neng)會(hui)有(you)(you)所幫助，以便更(geng)好地查看(kan)管(guan)內的內容(rong)。如(ru)果需要將(jiang)(jiang)卷(juan)(juan)曲轉(zhuan)(zhuan)移(yi)到新小(xiao)瓶(ping)中(zhong)，我們建議嘗試將(jiang)(jiang)產(chan)品小(xiao)瓶(ping)放(fang)在另一個小(xiao)瓶(ping)頂部，輕拍它，避免(mian)使用鑷(nie)子(zi)。或者，您可(ke)以先(xian)在原始管(guan)中(zhong)溶解卷(juan)(juan)曲，然后將(jiang)(jiang)所有(you)(you)內容(rong)物轉(zhuan)(zhuan)移(yi)到新管(guan)中(zhong)。

• 脫蠟后去除二甲苯時，要謹慎。只(zhi)取出 900 uL，其余留在(zai)小瓶(ping)中，以免擾亂(luan)沉淀物。在(zai)加入乙醇之前，在(zai)化(hua)學罩內風干。

• 只有在(zai)(zai)加(jia)入乙醇(chun)沉(chen)淀(dian)后(hou)，DNA 才會顯現(xian)出(chu)來。如果不容易看見，可在(zai)(zai)渦旋后(hou)倒置小瓶幾次以觀察它(ta)。沉(chen)淀(dian)物(wu)應呈白(bai)色膠狀物(wu)質(zhi)（圖(tu) 3B）。離心后(hou)，沉(chen)淀(dian)物(wu)應在(zai)(zai)管底呈顆(ke)粒狀清晰可見（圖(tu) 3C）。

• 離心沉(chen)淀后，盡可能多(duo)地(di)除去(qu)上清液(ye)，但(dan)要小心避免擾(rao)動和/或吸出沉淀物。使用較小尺寸的移液器(qi)可能(neng)會有所幫助。

Maxwell® RSC DNA FFPE 試劑(ji)盒（Promega） 

• 熔化和脫蠟(la)孵(fu)育溫度至關重要；溫度過(guo)高(gao)會導致(zhi) DNA 產量降(jiang)低，因為樣本(ben)中單(dan)鏈 DNA 過(guo)多。將小瓶密封(feng)也很重要。

• 沒(mei)有沉淀，因(yin)此丟(diu)失樣(yang)品的風險(xian)較低。然而，在(zai) RNAse 之后去除水層時必(bi)須小心(xin)一種處(chu)理方法，避免轉移任(ren)何變性(xing)的蛋白質界面(mian)，因(yin)為它會堵塞墨盒(he)并降低產量。

AllPrep® DNA /RNA FFPE 試(shi)劑盒 (Qiagen)

• 遵(zun)循(xun)與 QIAamp ® DNA FFPE 組織試(shi)劑盒(he)類似的總體(ti)預(yu)防措施

• 在(zai)用蛋白酶(mei) K 處理之(zhi)前將沉淀物重新懸浮(fu)在(zai)緩沖(chong)液(ye) PKD 中(zhong)時，可(ke)以通過用力添加緩沖(chong)液(ye)將其去除來實現(xian)可(ke)視化。

• 如果不是同時提取(qu) RNA，則在去除上清液時要(yao)謹慎(shen)，以免丟失 DNA。

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