今天(tian)我們就匯總了一些液相色譜柱使用過程中的常見問題,并給(gei)出針(zhen)對性的解(jie)決方(fang)案。快來看看是不(bu)是問到(dao)了你的心坎上呢?
問題 1:我的液(ye)相色譜(pu)柱上進樣量多少合適,同時可以(yi)避免譜(pu)帶展寬?
進樣量以及最佳流速(su)受色譜(pu)柱尺寸限制(zhi)。理想情況下,如(ru)果(guo)樣品(pin)與流動相(xiang)使用(yong)相(xiang)同的溶劑,進樣量范圍如(ru)下:
液相柱內徑 ID | 進樣量 (µL) |
2.1 mm (30 -100 mm 長) | 1-3 |
3.0-3.2 mm (50-150 mm 長) | 2-12 |
4.6 mm (50-250 mm 長) | 8-40 |
問題(ti) 2:如果(guo)我(wo)改(gai)用其它尺寸的色譜柱,應該如何調(diao)整(zheng)進樣量(liang)?
最佳進樣量(liang)與(yu)色譜柱的柱體積相關(guan),因此取(qu)決于色譜柱的橫截面積(A = π r2)和(he)長(chang)(chang)度(L)。您(nin)可以(yi)根據(ju)現(xian)有方法(fa)的(de)進樣量估算調整后(hou)的(de)進樣量。如果要轉換為不同(tong)內徑(ID)的(de)色(se)譜柱(zhu)(包裝材料和(he)長(chang)(chang)度保持(chi)不變),只需將當前進樣量乘以(yi)新舊色(se)譜柱(zhu)的(de)半徑平方之比即(ji)可確定新方法(fa)的(de)正確進樣量。
例如,如果當前在 150 x 4.6 mm 色譜柱上進樣量為 20 μL,準備切換到 150 x 3.0 mm 的色譜柱,則新色譜柱進樣量為 20 x (1.52) / (2.32),約(yue)為(wei) 8.5 μL。
問題 3:如(ru)果樣品(pin)/標準(zhun)品(pin)所使(shi)用溶(rong)劑比我的初始流動相洗脫能(neng)力強,會發生什么情(qing)況(kuang)?
圖(tu) 1:溶劑效應對峰形的影(ying)響
會發生溶劑效應,通常會導致峰變(bian)形、靈敏度差(cha)和保留(liu)時間縮短等問題。例如毒物分析中的(de)PFAS 分析中的(de) PFBA 會(hui)容易(yi)受(shou)溶(rong)劑(ji)(ji)效應影響,因此我們建(jian)議(yi)使用與初始(shi)流動(dong)相相近的(de)溶(rong)劑(ji)(ji)來(lai)避免溶(rong)劑(ji)(ji)效應。如果(guo)不(bu)便于(yu)這樣(yang)做,請在(zai)確保(bao)溶(rong)劑(ji)(ji)與流動(dong)相可以(yi)混溶(rong)的(de)前提下盡量(liang)減小進(jin)樣(yang)體積來(lai)消弱溶(rong)劑(ji)(ji)效應。
問(wen)題(ti) 4:如何確定(ding)液相色譜柱的總柱體積(ji)或空隙(xi)體積(ji)?
術語“色(se)譜柱體積(ji)"通常(chang)是指空隙體積,它代表(biao)二(er)氧(yang)化硅顆粒(li)之間的流動(dong)相體積。空隙體積可以(yi)通過(guo)總柱體積( π r2 L)乘以對應色譜柱的裝填系數來獲得。對于全多孔色譜柱,計算空隙體積(mL)的公式為 V = 0.68 π r2 L,其中 V = 柱體積,單位為 mL;r = 柱截面半徑,單位為厘米;L = 柱長,單位為厘米。對于表面多孔的色譜柱,例如我們的 Raptor 色譜柱,系數不同,空隙體積(mL)的公式為 V = 0.50π r2L 。
空隙體積(ji)通(tong)常通(tong)過進特定標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)進行實驗測(ce)定,該標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)需(xu)(xu)要在待測(ce)色譜柱(zhu)上無保留或保留可以(yi)忽略(lve)不計。反(fan)相(xiang)色譜柱(zhu)常用(yong)測(ce)試化合物是(shi)尿嘧啶。需(xu)(xu)要注意的是(shi),對于所使用(yong)的特定液(ye)相(xiang)儀器,測(ce)定值(zhi)還受到柱(zhu)外(wai)死(si)體積(ji)的影響,因此可能會略(lve)有不同。
問題 5:使(shi)用惰性色(se)譜柱(zhu)有什么好處?哪類(lei)化合物更適合用 Inert 惰性液相柱(zhu)分析?
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當通(tong)過(guo) HPLC 分析金屬敏感化(hua)合物時,流路中最大的(de)(de)金屬面積是液相色(se)譜柱的(de)(de)柱管(guan)。對柱管(guan)內壁進行惰性化(hua)處理(li)的(de)(de) Inert 色(se)譜柱,可以(yi)消(xiao)除金屬敏感化(hua)合物與(yu)金屬之間的(de)(de)非特異性吸附。從而為這類化(hua)合物提供更好的(de)(de)峰形和響應。
這類化合物(wu)(wu)包(bao)括:磷(lin)酸類化合物(wu)(wu)、酸性化合物(wu)(wu)、生(sheng)物(wu)(wu)分子-蛋白(bai)質、核(he)苷(gan)酸、寡核(he)苷(gan)酸等。
圖 2:待測(ce)物與金屬(shu)之間的非特異吸附
問題(ti) 6:分析金(jin)屬敏感(gan)化合物時,除了使(shi)用 Inert 惰性(xing)液(ye)相柱,我需(xu)要鈍(dun)化 HPLC 管路嗎?
如(ru)果您使(shi)用的液(ye)相儀器不是惰(duo)性(xing)(xing) HPLC 系統(tong),有(you)可能(neng)需要對(dui) HPLC 管路進(jin)行鈍化(hua),因為從進(jin)樣器到色譜柱之間流路中的金(jin)(jin)屬可能(neng)會對(dui)某些金(jin)(jin)屬敏感化(hua)合物(wu)產(chan)生一定影響。具體(ti)鈍化(hua)方法,歡(huan)迎(ying)您聯系我(wo)們獲取針(zhen)對(dui)性(xing)(xing)的幫(bang)助。
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